王乾興，金 華，何國(guó)平，楊高巧，張先平

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義習(xí)水縣人民醫(yī)院 急診科，貴州 遵義 564600；3. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 耳鼻喉科，貴州 遵義 563099；4.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，貴州 遵義 563099；5.遵義醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研究，貴州 遵義 563099)

細(xì)胞衰老是個(gè)體組織器官衰老的基礎(chǔ)。造血干細(xì)胞( Hematopoietic stem cell, HSC)的功能受細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞周期由細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)-細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDK)-細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子(CKI)共同調(diào)節(jié)。黃芪多糖為黃芪的主要藥物活性成分之一，它具有調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)造血、保護(hù)心肌、抗腫瘤和抗輻射損傷等方面的藥理作用[1-5]。但有關(guān)黃芪多糖能否延緩HSC衰老及其作用機(jī)理尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察黃芪多糖對(duì)衰老小鼠HSC細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響，探討黃芪多糖延緩HSC衰老的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 8周齡清潔級(jí)C57BL/6J小鼠，雌雄各半，體重18～20 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供。D-半乳糖購(gòu)自Sigma公司；黃芪多糖由陜西慈緣生物技術(shù)有限公司饋贈(zèng)；SA-β-gal Staining Kit購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；P16、CDK6及CyclinD兔多抗購(gòu)自Santa Cruz公司，β-actin兔單抗購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及處理 60只C57 BL/6J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、干預(yù)組，每組20只。模型組及干預(yù)組每天頸背部皮下注射5% D-半乳糖0.5 mL，對(duì)照組注射等劑量NS，每天1次，連續(xù)注射8周[6]。從注射第1天開(kāi)始，干預(yù)組每天給予黃芪多糖200 mg/kg灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃8周，對(duì)照組及模型組給予等劑量NS灌胃[7]。

1.3 HSC分離與鑒定[8]脫頸處死小鼠，取出股骨，IMDM培養(yǎng)液沖出骨髓，制備單細(xì)胞懸液，淋巴細(xì)胞分離液分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞。采用HSC最常見(jiàn)標(biāo)志物Sca-1鑒定及分選HSC，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HSC分選純度。

1.4 SA-β-Gal 染色 取1×106個(gè)HSC，PBS洗滌2次，按試劑盒說(shuō)明書操作。甘油封片鏡檢，以隨機(jī)計(jì)數(shù)的400個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 收集1×105個(gè)HSC，PBS洗滌，冰乙醇固定過(guò)夜。離心棄上清，PBS洗滌，37 ℃孵育。碘化丙啶避光反應(yīng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 免疫印記法檢測(cè)P16、CDK4及CyclinD蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞經(jīng)裂解液裂解后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉， P16、CDK4、CyclinD一抗(1∶500)及β-actin一抗(1∶1000)4 ℃過(guò)夜，洗膜，HRP標(biāo)記的二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光，曝光后凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果

2.1 HSC的分離純化 分選前骨髓單個(gè)核細(xì)胞中 Sca-1+細(xì)胞百分比為(12.74±1.06)%，經(jīng)免疫磁珠分離純化后Sca-1+細(xì)胞(即HSC)純度為(84.48±7.51)% ，提示分選的HSC具有較高的純度。

2.2 SA-β-Gal 染色陽(yáng)性率比較 與對(duì)照組比較，模型組SA-β-gal陽(yáng)性率顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，黃芪多糖能顯著抑制衰老小鼠HSC SA-β-gal陽(yáng)性率的增加(P<0.01，見(jiàn)表1)。

組別SA-β-gal染色陽(yáng)性率(%)對(duì)照組8.24±1.47模型組48.65±5.92#干預(yù)組10.83±2.61*

注：與對(duì)照組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.01。

2.3 細(xì)胞周期分布 與對(duì)照組比較，模型組HSC G1期比例顯著增加、S期比例顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，黃芪多糖能顯著抑制衰老小鼠HSC G1期比例的增加及S期比例的減少(P<0.01,見(jiàn)表2)。

組別G1期比例(%)M期比例(%)S期比例(%)對(duì)照組68.79±3.16 10.15±2.03 21.06±4.47 模型組84.64±3.07# 5.32±1.45#10.04±2.14#干預(yù)組 71.43±2.65* 9.46±1.76*19.11±4.18*

注：與對(duì)照組比較，#P<0.01；與模型組比較，＊P<0.01。

2.4 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá) D-半乳糖能增強(qiáng)衰老小鼠HSC P16蛋白表達(dá)、減弱CDK4、CyclinD蛋白的表達(dá)(P<0.05)；經(jīng)黃芪多糖干預(yù)后衰老小鼠HSC P16蛋白表達(dá)減弱、而CDK4及CyclinD蛋白表達(dá)均增強(qiáng)(P<0.05，見(jiàn)表1)。

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05;與模型組比較，*P<0.05。圖1 HSC細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P16、CDK4及CyclinD表達(dá)(n=6)

3 討論

SA-β-gal染色陽(yáng)性被廣泛認(rèn)為是細(xì)胞衰老的重要標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組HSC SA-β-gal染色陽(yáng)性率顯著增加，證明D-半乳糖可誘導(dǎo)小鼠HSC衰老。

細(xì)胞衰老最顯著的特點(diǎn)是表現(xiàn)為永久性細(xì)胞周期停滯。已有研究表明[9]，細(xì)胞周期中的G1期是細(xì)胞衰老的關(guān)鍵時(shí)期，該時(shí)期具有細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)。細(xì)胞周期的調(diào)控受Cyclin-CDK-CKI共同調(diào)節(jié)，CDK是細(xì)胞周期調(diào)控的核心，Cyclin為正性調(diào)節(jié)因子，CKI為負(fù)性調(diào)節(jié)因子。P16屬于CKI家族，在G1期關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)發(fā)揮重要作用，其機(jī)理是能與CDK4特異性地結(jié)合，阻止CyclinD/CDK4復(fù)合物的形成，使Rb蛋白低磷酸化，最終導(dǎo)致細(xì)胞不可逆地停滯于G1期。研究證實(shí)，清除P16 陽(yáng)性衰老細(xì)胞可以延緩脂肪組織、骨骼肌和眼等年齡相關(guān)疾病的進(jìn)展而延緩其衰老[10]。在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中，黃芪素以“益氣行血”著稱?！侗静菡氛J(rèn)為：“黃芪，因其味輕，故專于氣分而達(dá)表，所以能補(bǔ)元陽(yáng)，充腠理，治勞傷，長(zhǎng)肌肉。氣虛而難汗者可發(fā)，表疏而多汗者可止。其所以止血崩血淋者，以氣固而血自止也，故曰血脫益氣；其所以治瀉痢帶濁者，以氣固而陷自除也，故曰陷者舉之” 。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能顯著抑制衰老小鼠HSC SA-β-gal染色陽(yáng)性率的增加、G1期比例的增加及S期比例的減少；同時(shí)下調(diào)P16表達(dá)、上調(diào)CDK4與CyclinD表達(dá)。由此推測(cè)，黃芪多糖可能通過(guò)降低P16的表達(dá)來(lái)增加CyclinD/CDK4復(fù)合物的形成，使Rb蛋白磷酸化，從而使細(xì)胞能順利通過(guò)G1期調(diào)控點(diǎn)而進(jìn)入S期，因而可以對(duì)抗D-半乳糖所致的小鼠HSC衰老。

綜上所述，黃芪多糖可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)延緩HSC衰老，為開(kāi)發(fā)防治老年性疾病的有效藥物奠定理論基礎(chǔ)。

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