周銀麗+白建波+鄧玉華+黃繼文+王朝光+張虹

摘 要：黃酮類(lèi)化合物具有多種藥理作用，勐庫(kù)大葉茶中含有豐富的黃酮類(lèi)物質(zhì)。本試驗(yàn)采用乙醇恒溫浸提的方法提取勐庫(kù)大葉茶中的總黃酮，并結(jié)合正交試驗(yàn)選擇出最佳的提取工藝條件。結(jié)果表明4因素對(duì)勐庫(kù)大葉茶中總黃酮提取得率影響的主次順序?yàn)橐掖紳舛?固液比>提取溫度>提取時(shí)間，最佳提取工藝條件為乙醇濃度70 %、料液比1g：30 mL、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間2.0 h，在此條件下總黃酮的提取率為2.096 %。

關(guān)鍵詞：勐庫(kù)大葉茶 總黃酮 正交試驗(yàn) 最佳工藝

我國(guó)茶葉主要產(chǎn)地為云南、安徽、福建、湖南、浙江等地[1 ]，云南茶樹(shù)樹(shù)高葉大，茶味濃厚，習(xí)慣上都稱(chēng)之為“云南大葉種”，云南全省120個(gè)產(chǎn)茶縣中有大葉茶分布的近100個(gè)縣[2 ]。雙江是云南主要產(chǎn)茶縣之一，全縣轄勐庫(kù)等2個(gè)鎮(zhèn)及5個(gè)鄉(xiāng)，年產(chǎn)茶2210 t，該縣北部的勐庫(kù)鎮(zhèn)是國(guó)家級(jí)有性系茶樹(shù)良種勐庫(kù)大葉茶的原產(chǎn)地。勐庫(kù)大葉茶樹(shù)勢(shì)遒勁、芽葉肥壯、品質(zhì)超群，受到人們的喜愛(ài)[3，4 ]。

茶葉中含有豐富的黃酮，Hodgson的研究表明，經(jīng)常飲茶增加黃酮類(lèi)物質(zhì)攝入量能降低患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[5 ]；Grassi利用動(dòng)物模型研究表明飲食結(jié)構(gòu)中的類(lèi)黃酮物質(zhì)能延遲動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展[6 ]；Koutelidakis的研究表明，綠茶，白茶具有抗氧化效果，這種效果不僅在血漿中可以觀察到活性，在其他器官中同樣存在[4 ]；Wang的研究表明，喝紅茶和綠茶的防病效果不同，喝綠茶能減少患冠狀動(dòng)脈疾病的危險(xiǎn)[8 ]；Arts則研究了茶攝入量和肺癌的關(guān)系，該研究在不吸煙者和曾經(jīng)吸煙者間展開(kāi)，以消除吸煙的干擾效應(yīng)，7個(gè)實(shí)驗(yàn)中有4個(gè)證明飲茶對(duì)預(yù)防肺癌有顯著的作用[9 ]。黃酮類(lèi)化合物還具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抑菌抗病毒、抗輻射等多種藥理作用[10 ]。本文主要研究勐庫(kù)大葉茶中總黃酮的含量以及使用乙醇恒溫浸提提取勐庫(kù)大葉茶中總黃酮的最佳工藝條件，為今后勐庫(kù)大葉茶的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器與試劑

材料：勐庫(kù)大葉茶（干茶）；儀器：722S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海分析儀器總廠）、電子天平、恒溫水浴鍋、高速離心機(jī)等；試劑：蘆丁、無(wú)水乙醇、三氯化鋁、三氯化鐵、濃氨水、鹽酸、鎂粉、5 %亞硝酸鈉、10 %硝酸鋁等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮的提取

首先把500 g勐庫(kù)大葉茶干茶進(jìn)行粉碎，分別稱(chēng)取5 g碎茶葉，加入濃度為65 %、70 %、75 %的乙醇，封口置于溫度為75 ℃、80 ℃、85 ℃的恒溫水浴鍋一定時(shí)間（2 h、3 h、4 h），然后取出離心過(guò)濾。洗滌殘?jiān)ㄈ葜?0 mL容量瓶中，作為待測(cè)液備用（該待測(cè)液即為含茶葉總黃酮的溶液）。

1.2.2 黃酮的鑒定

對(duì)提取的黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行特征性實(shí)驗(yàn)，具體內(nèi)容如下。

鹽酸—鎂粉反應(yīng)：取1.0 mL提取液于試管中加適量鎂粉搖勻，再加入濃鹽酸數(shù)滴（1次加入），觀察其泡沫顏色；

三氯化鋁反應(yīng)：取提取液點(diǎn)在濾紙上，滴加1 %三氯化鋁乙醇溶液，吹干，觀察顏色變化；

三氯化鐵反應(yīng)：取幾滴提取液于濾紙上，滴加1 %三氯化鐵乙醇溶液，觀察其顏色；

氨顯色反應(yīng)：取乙醇提取液點(diǎn)在濾紙上，將濾紙?jiān)跐獍彼戏窖?.5 min，觀察其顏色變化。

1.2.3 測(cè)定方法及其依據(jù)

以蕓香苷為對(duì)照品測(cè)定茶葉中總黃酮的含量，加入鋁離子試劑，同時(shí)控制適當(dāng)?shù)膒H值，使黃酮化合物與鋁鹽形成絡(luò)合物，在可見(jiàn)光區(qū)能獲得特定的吸收峰。

1.2.4 定量實(shí)驗(yàn)-總黃酮的含量測(cè)定

1.2.4.1 波長(zhǎng)的選擇

取適量的樣品液，在0.30 mL5 %亞硝酸鈉溶液的堿性條件下，經(jīng)硝酸鋁顯色后，以試劑為空白參比液，在420～700 nm波長(zhǎng)范圍測(cè)定螯合物的吸光度，螯合物在510 nm處有最大吸收，故測(cè)定時(shí)選用510 nm的波長(zhǎng)。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

首先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精密稱(chēng)取120 ℃恒溫干燥至恒重的蕓香苷20 mg，置于100 mL容量瓶中，加入60 %乙醇溶液并稀釋至刻度，搖勻即得0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL分置于25 mL容量瓶中，分別加5 %亞硝酸鈉和10 %硝酸鋁溶液各4.0 mL，用30 %的乙醇稀釋至刻度，混勻，放置16 min。然后用722S 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此可得回歸方程D=11.133C-0.0134，r2 =0.9989，r=0.999，n=7。

1.2.5 乙醇恒溫浸提正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了確定乙醇恒溫浸提提取勐庫(kù)大葉茶中總黃酮最佳提取工藝條件，利用正交實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行試驗(yàn)。選用乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間及固液比4個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，用L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化[11 ]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮鑒定結(jié)果分析

鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈紫紅色；三氯化鋁反應(yīng)在可見(jiàn)光下呈灰藍(lán)色；三氯化鐵反應(yīng)呈紫色；氨顯色反應(yīng)在紫外光下呈極明顯的墨綠色熒光斑點(diǎn)，由表1的結(jié)果可證明待測(cè)液中含有黃酮類(lèi)化合物。

2.2 乙醇恒溫浸提勐庫(kù)大葉茶中總黃酮正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析見(jiàn)表2，乙醇濃度的極差（0.429）大于固液比的極差（0.277），而且遠(yuǎn)大于提取溫度極差（0.164）和提取時(shí)間的極差（0.095），4個(gè)因素對(duì)茶葉中黃酮提取得率影響的主次順序?yàn)锳>D>B>C，即乙醇濃度和固液比對(duì)提取得率的影響最大，提取溫度與提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響較小。最佳提取條件為A2B3C1D2，即乙醇濃度為70 %，固液比（g/mL）為1：30，提取溫度為85 ℃，提取時(shí)間為2 h時(shí)勐庫(kù)大葉茶茶葉黃酮得率最高，為2.096 %。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用乙醇恒溫浸提的方法提取勐庫(kù)大葉茶中的總黃酮，并且通過(guò)正交試驗(yàn)分析了影響黃酮提取率的4個(gè)因素。這4個(gè)因素對(duì)勐庫(kù)大葉茶中總黃酮提取得率的影響順序?yàn)橐掖紳舛?gt;固液比>提取溫度>提取時(shí)間。綜合各因素分析及考慮時(shí)間和資源耗用的情況，乙醇恒溫浸提提取勐庫(kù)大葉茶中總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度70 %、固液比（g/mL）1：30、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間2 h。最佳方案提取得率為2.096 %。

4 討論

試驗(yàn)提取勐庫(kù)大葉茶中的總黃酮得率為2.096 %，與姚小敏等用其他茶葉為材料提取黃酮的黃酮得率2.19 %十分接近[11 ]。最佳提取條件為乙醇濃度70 %、固液比（g/mL）1：30、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間2 h，4因素對(duì)茶葉提取得率影響的主次順序?yàn)橐掖紳舛?gt;固液比>提取溫度>提取時(shí)間，與王在貴等的研究結(jié)論相比也十分接近[12 ]。試驗(yàn)結(jié)果表明勐庫(kù)大葉茶中含有較高的黃酮類(lèi)化合物，有較高的飲用價(jià)值，可為勐庫(kù)大葉茶的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

參考文獻(xiàn)

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3 結(jié)論

試驗(yàn)采用乙醇恒溫浸提的方法提取勐庫(kù)大葉茶中的總黃酮，并且通過(guò)正交試驗(yàn)分析了影響黃酮提取率的4個(gè)因素。這4個(gè)因素對(duì)勐庫(kù)大葉茶中總黃酮提取得率的影響順序?yàn)橐掖紳舛?gt;固液比>提取溫度>提取時(shí)間。綜合各因素分析及考慮時(shí)間和資源耗用的情況，乙醇恒溫浸提提取勐庫(kù)大葉茶中總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度70 %、固液比（g/mL）1：30、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間2 h。最佳方案提取得率為2.096 %。

4 討論

試驗(yàn)提取勐庫(kù)大葉茶中的總黃酮得率為2.096 %，與姚小敏等用其他茶葉為材料提取黃酮的黃酮得率2.19 %十分接近[11 ]。最佳提取條件為乙醇濃度70 %、固液比（g/mL）1：30、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間2 h，4因素對(duì)茶葉提取得率影響的主次順序?yàn)橐掖紳舛?gt;固液比>提取溫度>提取時(shí)間，與王在貴等的研究結(jié)論相比也十分接近[12 ]。試驗(yàn)結(jié)果表明勐庫(kù)大葉茶中含有較高的黃酮類(lèi)化合物，有較高的飲用價(jià)值，可為勐庫(kù)大葉茶的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

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3 結(jié)論

試驗(yàn)采用乙醇恒溫浸提的方法提取勐庫(kù)大葉茶中的總黃酮，并且通過(guò)正交試驗(yàn)分析了影響黃酮提取率的4個(gè)因素。這4個(gè)因素對(duì)勐庫(kù)大葉茶中總黃酮提取得率的影響順序?yàn)橐掖紳舛?gt;固液比>提取溫度>提取時(shí)間。綜合各因素分析及考慮時(shí)間和資源耗用的情況，乙醇恒溫浸提提取勐庫(kù)大葉茶中總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度70 %、固液比（g/mL）1：30、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間2 h。最佳方案提取得率為2.096 %。

4 討論

試驗(yàn)提取勐庫(kù)大葉茶中的總黃酮得率為2.096 %，與姚小敏等用其他茶葉為材料提取黃酮的黃酮得率2.19 %十分接近[11 ]。最佳提取條件為乙醇濃度70 %、固液比（g/mL）1：30、提取溫度85 ℃、提取時(shí)間2 h，4因素對(duì)茶葉提取得率影響的主次順序?yàn)橐掖紳舛?gt;固液比>提取溫度>提取時(shí)間，與王在貴等的研究結(jié)論相比也十分接近[12 ]。試驗(yàn)結(jié)果表明勐庫(kù)大葉茶中含有較高的黃酮類(lèi)化合物，有較高的飲用價(jià)值，可為勐庫(kù)大葉茶的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

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