李亞文，徐世元，張慶國，李 樂，賴露穎，鄭 艇，蘇嬌玲，楊耐梅，李元濤

（1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院麻醉科，廣州 510282；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院麻醉科，廣東深圳 518028）

長期以來，過表達(dá)microRNA質(zhì)?？芍苯佑糜诩?xì)胞系轉(zhuǎn)染表達(dá)，是研究基因功能的重要方法。但用真核細(xì)胞構(gòu)建的表達(dá)載體在細(xì)胞轉(zhuǎn)染階段存在轉(zhuǎn)染率不高且周期長等弊端，限制其廣泛應(yīng)用；而慢病毒載體是以人類免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，它既能感染分裂細(xì)胞又能感染非分裂細(xì)胞，安全性高并可以在體內(nèi)較長期地表達(dá)。本實驗所用慢病毒載體感染目的細(xì)胞后不再感染其他細(xì)胞，也不會利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。

本研究通過構(gòu)建Grp78基因過表達(dá)慢病毒表達(dá)載體，為下一步感染SH－SY5Y細(xì)胞株，進(jìn)而研究Grp78在布比卡因神經(jīng)毒性所致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞損傷中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）主要試劑：瓊脂糖、PCR試劑盒、Taq polymerase，dNTP、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒抽提試劑盒。臺盼藍(lán)、胰酶、DMSO、DMEM、Lipofectamine 2000、細(xì)胞株：293T；菌株：大腸埃希菌菌株DH5α；病毒載體：GV 載體、pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體。（2）主要儀器：PCR儀、穩(wěn)壓DNA電泳儀、凝膠成像儀、培養(yǎng)箱、高速離心機(jī)、熒光顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增目的基因 （1）載體信息：GV261；元件順序：Ubi－MCS－IRES－Cherry；克隆位點：AgeI／NheI。（2）目的基因片段Grp78引物，上游：5′－CGG GTA CCG GTC GCC ACC ATG AAG CTC TCC CTG GTG G－3′；下 游：5′－AGT CGC TAG CCT ACA ACT CAT CTT TTT CTG CTG TAT C－3′。

1.2.2 制備感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化 CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗步驟如下：（1）各取每種感受態(tài)細(xì)胞懸液200μL轉(zhuǎn)移至無菌微量離心管中，每管加入連接液10μL，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻，然后置冰中放置30min。制備感受態(tài)細(xì)胞，使其具有攝取外源DNA的能力。（2）42℃熱休克90s?？焖賹⒐苻D(zhuǎn)移到冰浴中冷卻細(xì)胞1～2min。每管加入800μL LB培養(yǎng)基。水浴加溫至37℃，然后放置搖床溫育45min以復(fù)蘇細(xì)菌。（4）將150μL轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到AMP（100μg／mL）抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基上。把平板置于室溫直至液體被吸收。然后倒置平皿，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。（5）克隆進(jìn)行后續(xù)PCR鑒定。

1.2.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建 PCR產(chǎn)物連接入線性化表達(dá)載體反應(yīng)體系見表1，反應(yīng)條件 ：25℃30min；42℃15min。

1.2.4 Lentivirus病毒包裝 消化293T細(xì)胞，調(diào)整其密度為每20mL有1.2×107個細(xì)胞，接種細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，放置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞狀態(tài)對于病毒包裝至關(guān)重要，需要保證良好的細(xì)胞狀態(tài)和較少的傳代次數(shù)。轉(zhuǎn)染前2h將含胎牛血清培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。向一離心管中加入制備的各DNA溶液（pGC－LV 載 體20μg、pHelper 1.0 載體15μg、pHelper 2.0載體10μg）與相應(yīng)體積培養(yǎng)基混合均勻，調(diào)整總體積為2.5mL，室溫下溫育5min。將Lipofectamine 2000試劑輕柔搖勻，取100μL Lipofectamine 2000試劑在另一管中與2.4mL Opti－MEM培養(yǎng)基混合，室溫下溫育5min。把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000進(jìn)行混合，輕顛混勻，避免振蕩，且須5min內(nèi)混合。混合后室溫下溫育20min，然后將混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，混合均勻，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8h后倒去培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20mL磷酸鹽緩沖液（PBS），以洗滌殘余混合液，移去混合液。每瓶細(xì)胞中加入含10% 胎牛血清培養(yǎng)基25mL，放置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2d。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.2.5 Lentivirus滴度測定

1.2.5.1 樣品制備 293T細(xì)胞傳代，24孔中每個孔加入1×105個細(xì)胞，體積為500μL；次日準(zhǔn)備10個無菌Ep管，每管中加90μL培養(yǎng)基；取待測病毒原液10μL加入到第一個管中，混合均勻，取混合均勻的第一管液10μL加入到第二個管中繼續(xù)相同的操作直到最后一管；選取所需細(xì)胞孔，吸去90μL培養(yǎng)基。加稀釋好的病毒溶液，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；1d后，加入新鮮培養(yǎng)基500μL。小心操作；4d后抽提RNA。

1.2.5.2 總RNA抽提 去細(xì)胞上清液，每孔加入1mL Trizol，吹打，室溫靜置5min，轉(zhuǎn)移至另一新1.5mL Ep管中。每管加200μL氯仿，用力震蕩15s，室溫下靜置15min。4℃下12000r／min離心15min。從每管中吸取上清液至另一新1.5 mL Ep管中。加入等體積－20℃預(yù)冷的異丙醇，混勻后－20℃沉淀10min。4℃下12000r／min離心10min，移去上清液。加入1mL 4℃預(yù)冷的75%乙醇，洗滌沉淀及離心管壁。4℃下10000r／min離心5min，移棄上清液。4℃下10000 r／min再次離心5min，吸去殘液，室溫下干燥，不需完全干燥。加20μL無RNA酶（RNase）水至完全溶解，紫外分析測定所抽提RNA濃度。

1.2.5.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄獲cDNA 將1μL Oligo dT（0.5μg／μL）和2.0μg總RNA加入PCR小管，補(bǔ)焦碳酸二乙酯（DEPC）水至9μL?；旌暇鶆颉㈦x心，70℃溫浴10min。緊接著插入到0℃冰水浴中。按下表比例，根據(jù)反應(yīng)管數(shù)算出所需試劑量。將M－MLV酶等在冰上混勻得到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。在每個反應(yīng)管中加11μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，混合均勻后離心。其中，11μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液含5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL、10mmol／L dNTPs 2μL、RNA 抑制劑 0.5μL、M－MLV－RTase 1μL、DEPC水3.5μL。在42℃進(jìn)行1h完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，后用70℃處理10min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物cDNA可用于PCR，也可－80℃長期保存。

1.2.5.4 實時定量PCR檢測 實時定量PCR在Takara的TP800PCR儀上完成。配置反應(yīng)體系：每管加入SYBR premix ex Taq 10μL、上游引物（5μmol／L）1.0μL、下游引物（5μmol／L）1.0μL、cDNA 1.0μL、ddH2O 7.5μL。設(shè)定程序為兩步法實時定量PCR。預(yù)變性95℃5s；變性95℃5s，退火60℃30s，延伸60℃30s，40個循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值，用于制作熔解曲線。PCR結(jié)束后，在95℃變性1 min。然后冷卻至55℃，使DNA雙鏈充分聚合。從55℃開始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30s，同時讀取吸光值。兩個循環(huán)后將調(diào)定點升高0.5℃。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果 陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大?。?10 bp，見圖1。

圖1 PCR鑒定轉(zhuǎn)化結(jié)果電泳圖

2.2 病毒的收獲及濃縮 收集轉(zhuǎn)染后2d的293T細(xì)胞上清液。4℃、4000×g離心10min，以除去細(xì)胞碎片。用0.45 μm過濾器過濾上清液到40mL超速離心管中。把病毒粗提液樣品加入過濾杯中。將過濾杯插到濾過液收集管中，再4000×g離心至所需病毒濃縮體積，時間15min。離心結(jié)束后取出離心裝置，將過濾杯和濾過液收集杯分開。將過濾杯倒扣在樣品收集杯上，離心力不超過1000×g，時間2min。過高轉(zhuǎn)速會使樣品損失。把過濾杯從樣品收集杯上移開。樣品收集杯中即為病毒濃縮液。將病毒濃縮液移出，進(jìn)行分裝；取其中一支進(jìn)行滴度測定，其余置－80℃長期保存。

2.3 實時定量PCR法測定綠色熒光蛋白標(biāo)記的慢病毒滴度

圖2 實時定量PCR曲線圖

2.3.1 引物信息 綠色熒光蛋白（GFP）引物：被擴(kuò)增的片段位于211～496bp之間，其上游引物序列為5′－TGC TTC AGC CGC TAC CC－3′，熔點Tm為57.4℃，GC百分含量為64.7%。下游引物序列為5′－AGT TCA CCT TGA TGC CGT TC－3′，熔點Tm為57.3℃，GC百分含量為50.0%。β－actin被擴(kuò)增的片段位置位于932～1233bp之間，其上游引物序列為5′－GTG GAC ATC CGC AAA GAC－3′，熔點 Tm 為52.6℃，GC百分含量為55.6%。下游引物序列為5′－AAA GGG TGT AAC GCA ACT A－3′，熔點Tm為51.0℃，GC百分含量為42.1%。

2.3.2 實時定量PCR結(jié)果 在該次病毒滴度檢測中，1.00E－03μL組樣品與對照組樣品的Ct值差異大于3以上，故認(rèn)定病毒顆粒存在于1.00E－03μL組樣品中。見圖2。

2.4 β－actin、GFP熔解曲線 見圖3。

圖3 β－actin、GFP熔解曲線

3 討 論

通過慢病毒載體的構(gòu)建、包裝，得到穩(wěn)定表達(dá)的質(zhì)粒；該質(zhì)粒能有效應(yīng)用于研究Grp78基因過表達(dá)來減少細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［1］。該質(zhì)粒較采用真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染得到的質(zhì)粒感染細(xì)胞的成功率高［2－3］。觀察 GFP表達(dá)情況［4－5］，在加入 1E－5μL病毒原液的孔中觀察到3個細(xì)胞存活，說明該孔中至少有3病毒顆粒感染細(xì)胞，且認(rèn)為該病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量。在加入1E－6μL病毒原液的孔中觀察到2個帶有熒光的細(xì)胞，說明該孔中至少有2個病毒顆粒感染細(xì)胞，且認(rèn)為該病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量，即2／（1E－6）＝2E＋6，單位為 TU／μL，也就等于2E＋9 TU／mL。

加入不同病毒量的細(xì)胞樣品，通過提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行定量PCR檢測，通過對照組與實驗組的Ct值差異來判斷滴度值。通常情況下認(rèn)為Ct值差異2以上存在顯著差異［6］。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所獲得20μL cDNA中只取1μL用于實時定量PCR檢測，該結(jié)果僅表示1／20樣品的情況，所以在滴度計算時乘以系數(shù)20。

退火溫度偏低，可引起非特異性擴(kuò)增。適當(dāng)提高退火溫度可降低非特異性擴(kuò)增。故通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。非特異性條帶的出現(xiàn)，原因諸多，引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體、退火溫度過低、PCR循環(huán)次數(shù)過多等。針對解決措施有降低引物量、減少循環(huán)次數(shù)、適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。熔解曲線中，由于SYBR GreenⅠ與所有雙鏈DNA相結(jié)合，引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量精確性。故由熔解曲線來分析產(chǎn)物的均一性更有助于準(zhǔn)確分析SYBR Green實時定量 PCR 結(jié)果［7－13］。

設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，注意交叉污染可能。每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對照。PCR結(jié)束后，根據(jù)發(fā)生過程中熒光值變化繪出每個樣品的熔解曲線。熔解曲線是擴(kuò)增反應(yīng)的質(zhì)控途徑，圖中沒有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬，表明實驗中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。不同的擴(kuò)增產(chǎn)物因為其長度和GC含量不同而在不一樣的溫度下解鏈，當(dāng)產(chǎn)物解鏈時，SYBR GreenⅠ的熒光值將降低并被儀器所監(jiān)測。繪制熔解曲線時，需實時定量PCR儀連續(xù)監(jiān)測每個樣品在從雙鏈完全配對到完全解鏈的升溫過程中熒光值的變化，由此繪制出熒光強(qiáng)度隨溫度變化的負(fù)一次倒數(shù)圖。熒光強(qiáng)度變化的拐點（熔點，Tm）即為熔解峰值。Grp78過表達(dá)病毒載體的構(gòu)建和包裝成功，為今后研究Grp78基因在布比卡因所致神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為布比卡因神經(jīng)毒性的防治打開一扇科學(xué)之門。

［1］李亞文，徐世元，張慶國，等.高糖環(huán)境誘導(dǎo)SH－SY5Y細(xì)胞ROS爆發(fā)－內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強(qiáng)布比卡因神經(jīng)毒性［D］.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

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