呂鐵偉，孫慧超，張 蕾，劉玲娟，吳曉云，劉曉燕，朱 靜，劉振國，田 杰△

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400014；2.兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點實驗室／兒科學(xué)重慶市重點實驗室／重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國際科技合作基地，重慶 400014；3.美國俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，哥倫布 43210）

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs）是經(jīng)過實驗室純化的單一干細(xì)胞株，已經(jīng)被證明能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為具有內(nèi)皮功能的成熟內(nèi)皮細(xì)胞［1］，其可以作為以內(nèi)皮受損或功能失調(diào)為基礎(chǔ)病理改變的動脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病的根治種子細(xì)胞。而氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox－LDL）是導(dǎo)致動脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素，Oct－4（octamer binding transcription factor－4）是高表達于干細(xì)胞的八聚體轉(zhuǎn)錄因子，能夠維持干細(xì)胞自我更新的能力，而在干細(xì)胞定向分化的過程中表達逐漸減弱甚至消失，是當(dāng)前公認(rèn)的干細(xì)胞表面標(biāo)記之一。本文以MSCs為研究對象，擬在MSCs體外培養(yǎng)過程中加入ox－LDL進行干預(yù)，明確其對MSCs增殖能力和Oct－4表達情況的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 MSCs為俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心劉振國實驗室分離和提純的細(xì)胞株，細(xì)胞培養(yǎng)體系包括低糖DMEM培養(yǎng)液（Gibco）、MCDB、ITS、LA－BSA、L－ascorbic acid、EGF（均購自Sigma）、PDGF（R＆D Systems）、β－Mercaptoethanol（Fisher公司）、LIF（Esgro公司）和青／鏈霉素（Cellgro公司），ox－LDL及天然低密度脂蛋白（native low density lipoprotein，nLDL）為俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Sam′s實驗惠贈，蛋白免疫印跡法（West blot）檢測 Oct－4、Bcl－2相關(guān)試劑及抗氧化劑乙酰半胱氨酸（N－acetylcycteine，NAC）購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 MSCs培養(yǎng)傳代 本研究將MSCs以100～200／cm2的密度接種于玻璃培養(yǎng)皿中，置入37℃、5%CO2和5%O2的孵箱中培養(yǎng)，一般2～3h細(xì)胞即貼壁生長，細(xì)胞培養(yǎng)24～48h后在細(xì)胞相互接觸之前，采用胰酶消化傳代細(xì)胞，每個培養(yǎng)皿中加入胰酶1mL消化細(xì)胞，收集細(xì)胞于10mL試管中，4℃1500r／min離心，培養(yǎng)基混懸細(xì)胞，計數(shù)，以低密度（100～200／cm2）接種于新的培養(yǎng)皿放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.2.2 ox－LDL影響細(xì)胞增殖能力的檢測 MSCs被分為4組：ox－LDL組，在培養(yǎng)基中加入不同濃度（1、5、10、20μg／mL）的ox－LDL；ox－LDL＋NAC組，采用抗氧化劑 NAC預(yù)處理后再在培養(yǎng)基中加入ox－LDL；陰性對照組，在培養(yǎng)基中加入相對應(yīng)濃度的nLDL；對照組，MSCs放在正常培養(yǎng)不加其他任何干預(yù)因素；ox－LDL組分別在培養(yǎng)基加入終濃度分別為1、5、10、20μg／mL的ox－LDL；nLDL組則加入與ox－LDL相對應(yīng)濃度的nLDL；在細(xì)胞培養(yǎng)的第12、24和48小時收集3組細(xì)胞，計數(shù)并繪制生長曲線，每實驗組要求的樣本量分別為3個。

1.2.3 檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2及Oct－4的表達 采用蛋白提取試劑盒提取不同時間點細(xì)胞總蛋白，分光光度計測定蛋白濃度，按照蛋白印跡技術(shù)檢測Bcl－2和Oct－4的表達，首先進行變性十二烷基硫酸鈉－聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），放入電轉(zhuǎn)系統(tǒng)恒流轉(zhuǎn)膜2h后，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，封閉結(jié)束后加入相對應(yīng)的一抗于4℃孵育過夜，TBST洗膜后加二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的與一抗相對應(yīng)的種屬特異性二抗）室溫震蕩孵育1h，TBST洗膜后加入化學(xué)發(fā)光劑室溫孵育3min，暗室中進行定影顯影，采用凝膠圖形分析軟件對特異性條帶進行灰度掃描和定量分析，蛋白的灰度值用內(nèi)參GAPDH進行校正。

1.2.4 氧化活性產(chǎn)物（ROS）檢測 采用電子順磁震蕩（EPR）技術(shù)檢測各組培養(yǎng)基中ROS的含量。首先收集細(xì)胞計數(shù)，使細(xì)胞濃度達到107／mL，每個樣本中抽取100μL細(xì)胞懸液加入EPR微小玻璃吸管中，再置于EPR儀器進行檢測，每個樣本重復(fù)進行3次測定，描繪各組的EPR信號，統(tǒng)計EPR信號強度并進行對比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS15.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，曲線及直方圖采用Sigmaplot軟件繪制，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)階段的形態(tài) 將 MSCs以低密度（100～200／cm2）接種培養(yǎng)在氧含量為5%的CO2孵箱中，大約2～3h后細(xì)胞全部貼壁，貼壁細(xì)胞在倒置顯微鏡下呈梭形、圓形或不規(guī)則形狀，細(xì)胞體積大，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞間互不接觸，培養(yǎng)48h后細(xì)胞增殖明顯增加，幾乎鋪滿培養(yǎng)皿底部，細(xì)胞間形成接觸。

2.2 ox－LDL影響MSCs增殖能力的檢測結(jié)果 細(xì)胞培養(yǎng)皿底部面積約為53cm2，每個培養(yǎng)皿總接種細(xì)胞數(shù)約為（1～2）×104，加6mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后細(xì)胞數(shù)量約擴增為4×105個，大約擴增20倍，傳代后細(xì)胞仍保持同樣的擴增能力。細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示ox－LDL對 MSCs增殖的抑制作用與培養(yǎng)時間和干預(yù)濃度呈正相關(guān)：與正常培養(yǎng)細(xì)胞相比，濃度為1μg／mL的ox－LDL使 MSCs增殖速度稍有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而濃度為5μg／mL和10μg／mL時則導(dǎo)致 MSCs的增殖速度明顯減弱（5μg／mL時P＜0.05，10 μg／mL 時 P ＜0.01），其 中，10μg／mL 及20μg／mL在培養(yǎng)的不同時間點細(xì)胞數(shù)量增加極少，到48h細(xì)胞增加的量不到初始接種濃度的1倍，見圖1，而nLDL組細(xì)胞增殖未受影響（結(jié)果未顯示），NAC預(yù)處理后提高了 MSCs的數(shù)量，但在ox－LDL濃度為10、20μg／mL時提升效率不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而在5μg／mL時，NAC預(yù)處理后大大增加了MSCs的數(shù)量（P＜0.05），見圖2。

2.3 不同濃度ox－LDL引起細(xì)胞凋亡及對Bcl－2表達水平的影響 在MSCs體外培養(yǎng)過程中，與原代培養(yǎng)的細(xì)胞相比，高濃度的ox－LDL明顯抑制MSCs的增殖，顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量明顯減少，大部分細(xì)胞已破碎且失去了細(xì)胞完整的結(jié)構(gòu)，見圖3；采用Western blot觀察ox－LDL干預(yù)后不同實驗組Bcl－2表達情況發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，用10μg／mL及以上濃度的ox－LDL進行干預(yù)后的細(xì)胞抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl－2幾乎沒有出現(xiàn)表達，NAC預(yù)處理后則出現(xiàn)Bcl－2的表達，但表達量與對照組比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，具體數(shù)據(jù)未顯示），見圖4。

圖1 各濃度ox－LDL對MSCs增殖的影響

圖2 抗氧化劑NAC對ox－LDL處理后MSCs增殖的逆轉(zhuǎn)作用

圖3 原代培養(yǎng)傳代前（左）和ox－LDL干預(yù)后（右）細(xì)胞形態(tài)的改變（×100）

2.4 ox－LDL對干細(xì)胞表面標(biāo)記Oct－4表達水平的影響 本實驗采用 Western blot觀察ox－LDL對Oct－4表達水平的影響，在細(xì)胞體外培養(yǎng)24h，分別提取濃度為5μg／mL的ox－LDL組和對照組細(xì)胞蛋白進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5μg／mL ox－LDL組Oct－4的表達明顯減弱，表達相對量僅為對照組的14%左右，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，具體數(shù)據(jù)未顯示），見圖5，10μg／mL及以上濃度的ox－LDL干預(yù)后Oct－4的表達更減弱，僅有極微量的表達（結(jié)果沒有顯示），而NAC預(yù)處理后Oct－4的表達量恢復(fù)接近正常，約為79%。而nLDL組Oct－4的表達卻沒有受到明顯影響。

圖4 不同實驗組Bcl－2的表達

2.5 NAC阻止ox－LDL來源的ROS的產(chǎn)生 EPR技術(shù)檢測不同實驗組培養(yǎng)體系中ROS的形成情況，結(jié)果顯示對照組沒有出現(xiàn)EPR信號，5μg／mL ox－LDL組則出現(xiàn)典型的EPR信號，而ox－LDL＋NAC組中則沒有檢測到EPR信號（圖6）；ROS的產(chǎn)生具有時間依賴性，當(dāng)ox－LDL干預(yù)MSCs時培養(yǎng)體系中即刻就出現(xiàn)EPR信號，信號表達的強度在ox－LDL干預(yù)后60s達到最高峰，以后穩(wěn)定在高水平狀態(tài)（圖6B）；同樣ROS的產(chǎn)生是劑量依賴型的，正常培養(yǎng)的細(xì)胞體系幾乎檢測不到EPR信號，而加入ox－LDL干預(yù)后的細(xì)胞體系EPR信號強度明顯增加，且隨著ox－LDL干預(yù)濃度的增加，EPR信號強度相應(yīng)增加，但是培養(yǎng)體系經(jīng)抗氧化劑NAC預(yù)處理5min后，即便再加入ox－LDL干預(yù)，細(xì)胞培養(yǎng)體系中EPR信號強度則明顯減弱接近正常細(xì)胞水平（圖6C），而nLDL組則沒有類似現(xiàn)象，說明培養(yǎng)體系中ROS的產(chǎn)生來源于ox－LDL，且ROS產(chǎn)生量與ox－LDL的濃度和作用時間呈正相關(guān)，但抗氧化劑NAC預(yù)處理后可以完全阻止ox－LDL來源的ROS的產(chǎn)生。

圖5 不同組別Oct－4的表達情況

圖6 不同組別活性氧產(chǎn)物ROS形成的檢測結(jié)果

3 討 論

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為成體干細(xì)胞的一種，具有自我更新和多向分化的特點，其存在于骨髓基質(zhì)中，含量極低（0.1‰），但在體外擴增容易，適宜條件下自身數(shù)量能夠迅速增加，另外骨髓基質(zhì)是低氧環(huán)境（小于7%），該環(huán)境能夠維持細(xì)胞的無限增殖和自我更新的能力，體外低氧條件下培養(yǎng)能最大限度發(fā)揮細(xì)胞的生物學(xué)特性［2－3］。而體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混雜有少量如成纖維細(xì)胞等其他細(xì)胞群體，這種混雜細(xì)胞群體會影響研究的準(zhǔn)確性和單一性，因此，本實驗所采用的MSCs為俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心實驗室分離和提純的細(xì)胞株，被認(rèn)為是單一的干細(xì)胞株，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞群陽性表達Oct－4，Rex－1，c－Kit和 Pdgfr－α，而細(xì)胞表面標(biāo)記 Sca－1，CD34，CD45，Sox－2和 Nanog的表達卻為陰性［3］；Oct－4屬 POU 家族蛋白，是一類在動物早期胚胎發(fā)育過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，能夠維持干細(xì)胞的全能性及未分化狀態(tài)［4］。Oct－4蛋白的主要結(jié)構(gòu)特征為具有POU家族特有的保守結(jié)構(gòu)域（POUs）和POU同源異型結(jié)構(gòu)域（POUHD），這兩個結(jié)構(gòu)域可與DNA上特定區(qū)域形成雙向結(jié)合，進而對基因轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控［5］。本實驗顯示 MSCs高表達Oct－4，當(dāng) MSCs受到ox－LDL干預(yù)時Oct－4的表達明顯降低，細(xì)胞的增殖能力顯著下降，進一步證實Oct－4是維持干細(xì)胞的全能性及未分化狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。

內(nèi)皮遍及整個心血管系統(tǒng)，主管血液運輸、物質(zhì)交換和血管活性物質(zhì)的分泌等功能，內(nèi)皮的受損或功能失調(diào)導(dǎo)致動脈粥樣硬化和冠心病等心血管事件的發(fā)生和發(fā)展［6］，故內(nèi)皮正常功能的重建或內(nèi)皮再生是嚴(yán)重心血管事件未來治療的主攻方向。內(nèi)皮再生來源于循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs），內(nèi)皮細(xì)胞受損或者破壞導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少，可觸發(fā)循環(huán)EPCs的成熟過程，最后EPCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞來彌補其數(shù)量的不足從而維持心血管內(nèi)皮系統(tǒng)的正常功能，而EPCs來源于骨髓，其數(shù)量和功能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)；臨床上內(nèi)皮受損或功能失調(diào)導(dǎo)致動脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病的發(fā)生，研究證實這些心血管疾病個體體內(nèi)EPCs的數(shù)量明顯減少［6－8］，因此，推測可能是某些因素導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化受到抑制，繼而內(nèi)皮細(xì)胞的生成數(shù)量降低，從而促進嚴(yán)重心血管事件的發(fā)生，因此，該過程中相關(guān)機制的闡明具有重大的臨床和社會意義，也是本研究實施的原始推動力。

多種因素可以引起內(nèi)皮受損或功能失調(diào)，脂代謝紊亂是一大誘因，高脂血癥導(dǎo)致內(nèi)膜受損，脂點脂紋形成，繼而出現(xiàn)纖維斑塊和粥樣斑塊。最后導(dǎo)致動脈粥樣硬化和冠心病的形成，而ox－LDL和氧化應(yīng)激是這一過程的物質(zhì)和病理生理基礎(chǔ)，但其作用機制尚不清楚。ox－LDL對靶細(xì)胞的作用因細(xì)胞類型不同而不同，并且這種作用機制復(fù)雜而多變，ox－LDL能夠促進巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的增殖，抑制巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞的凋亡，但另一方面ox－LDL在抑制內(nèi)皮細(xì)胞和循環(huán)EPCs的增殖進而促進巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的凋亡［9－10］，最近文獻又證明ox－LDL同樣可以引起內(nèi)皮的受損［11］，但受損的機制尚未闡明；ox－LDL另外一個重要的機制則是ROS的形成和氧化應(yīng)激。Ox－LDL能夠提供ROS的豐富來源，而ROS與組織氧化應(yīng)激和高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生及進展密切相關(guān)，ROS和氧化應(yīng)激在對包括骨髓干細(xì)胞在內(nèi)的干細(xì)胞調(diào)控發(fā)揮重要作用［12－14］。

本研究結(jié)果是通過細(xì)胞的體外實驗獲得的，但仍具有緊密的臨床相關(guān)性，最近的臨床研究顯示一個健康個體血清中ox－LDL的濃度為7μg／mL，而穩(wěn)定型冠心病患者血清ox－LDL水平則為17.2μg／mL，急性冠脈綜合征患者血清ox－LDL水平更是高達23.6μg／mL，本實驗選取的 ox－LDL濃度（1～20μg／mL）在健康和患病個體的平均范圍之內(nèi)進行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ox－LDL濃度是1μg／mL時對細(xì)胞形態(tài)和增殖沒有影響，但當(dāng)其濃度增加，出現(xiàn)了抑制作用，并且這種作用與濃度成劑量依賴性，這就提示ox－LDL在這些心血管事件的發(fā)生發(fā)展中起促進作用，本實驗中采用抗氧化劑NAC預(yù)處理來對抗ox－LDL對細(xì)胞的抑制作用，根據(jù)相關(guān)文獻［13］選取濃度為1mM的NAC進行實驗，結(jié)果顯示NAC能夠逆轉(zhuǎn)但不能夠完全恢復(fù)ox－LDL對MSCs的抑制作用，提示在該過程中還有其它因素參與其中，下一步作者擬通過體內(nèi)實驗研究ox－LDL對MSCs特性和內(nèi)皮分化的影響及其機制。

本研究明確ox－LDL能夠抑制 MSCs增殖和MSCs細(xì)胞表面標(biāo)記Oct－4的表達，而抗氧化劑NAC卻能夠逆轉(zhuǎn)ox－LDL對MSCs的抑制作用，進一步證實了ox－LDL可能通過氧化應(yīng)激方式抑制MSCs的增殖和細(xì)胞表面標(biāo)志的表達，而抗氧化劑使氧化應(yīng)激水平降低甚至消退時，ox－LDL對MSCs的抑制作用也隨之降低甚至消退。而研究顯示心血管疾病個體體內(nèi)EPCs的數(shù)量明顯減少［6－8］，是否與其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化受到抑制導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的生成減少相關(guān)？而Ox－LDL是動脈粥樣硬化和冠心病等心血管事件發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，在本研究明確ox－LDL抑制MSCs生物學(xué)特性基礎(chǔ)上，擬通過進一步實驗驗證其是否抑制MSCs的內(nèi)皮分化及其可能機制。

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