黃 穎，伍偉鋒

（1.廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院心血管內(nèi)科二病區(qū)，廣西南寧 530001；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管病研究所，廣西南寧 530021）

臨床研究已明確，約30%高血壓患者有左室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH），這類患者的心血管病病死率較無(wú) LVH 的高血壓患者高8倍（16%vs.2%）［1－2］，一個(gè)十分重要的原因在于前者容易發(fā)生室性心律失常（ventricular arrhythmia，VA），但與之相關(guān)的基礎(chǔ)性研究較少，特別是有關(guān)SHR大鼠LVH與VA發(fā)生關(guān)系方面，目前尚無(wú)報(bào)道。Langendorff灌注是采用恒壓或恒流方式從主動(dòng)脈根部逆向用含氧灌流液灌流，保持哺乳動(dòng)物離體心臟存活從而對(duì)VA動(dòng)物模型觀察心功能的方法，排除了神經(jīng)、體液因素和心臟前后負(fù)荷等對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。本研究旨在通過(guò)觀察SHR大鼠和對(duì)照大鼠的離體心臟在Langendorff灌注低鉀液時(shí)誘發(fā)VA的敏感性差異，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度為L(zhǎng)VH在高血壓患者誘發(fā)VA中的作用做進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 主要材料 7周和15周的雄性SHR大鼠（由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），用尾袖法連續(xù)無(wú)創(chuàng)測(cè)鼠尾動(dòng)脈壓1周，時(shí)間均固定于8：00～14：00，每只大鼠在其安靜狀態(tài)下測(cè)量血壓3次，隨機(jī)取血壓平均值超過(guò)正常上限的大鼠各12只入組，分為16周高血壓的LVH組和8周高血壓無(wú)LVH的非LVH對(duì)照組，另購(gòu)15周雄性Wistar大鼠12只連續(xù)測(cè)壓1周確定血壓在正常水平后作為空白對(duì)照組。Masson染色試劑盒（上海生工）；Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)、ALC－B5恒流泵、MPA－心功能分析系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；MS4000U生物信號(hào)定量記錄分析系統(tǒng)（廣州市龍飛達(dá)科技有限公司）；XD－2A型心臟電生理診療儀（蘇州東方電子儀器廠）；針灸針電極，自制。本實(shí)驗(yàn)所需其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 Langendorff離體心臟灌注 用木錘擊昏動(dòng)物后，迅速將心臟連同一段主動(dòng)脈取出，將主動(dòng)脈套進(jìn)心臟插管口內(nèi)固定。心臟經(jīng)充氧的溫K－H液（以95%O2＋5%CO2混合氣飽和，恒溫37 ℃，NaCl 6.92g／L，KCl 0.35g／L，CaCl20.28 g／L，MgSO4·7H2O 0.29g／L，KH2PO40.16g／L，NaHCO32.1g／L，葡萄糖2.0g／L，pH 7.4）預(yù)灌流。將2個(gè)電極分別置于心臟心尖部和主動(dòng)脈根部，連接多道生物信號(hào)記錄儀。首先灌流K－H液20min后，灌入低鉀液（KCl 0.175g／L，其余同普通K－H液）60min（除非持續(xù)時(shí)間大于2min的SVF提早出現(xiàn)），同時(shí)記錄心臟心室內(nèi)壓和流出液，心電示波器全程監(jiān)測(cè)并記錄心電圖（ECG），觀察各組發(fā)生心律失常的情況。參照心律失常評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［2］進(jìn)行評(píng)分，并參照文獻(xiàn)［3］剔除不合格樣本。

1.2.2 大鼠心肌組織病理學(xué)檢查 將大鼠離體心臟用生理鹽水沖洗吸干，將左心室游離壁心肌組織固定于10%甲醛液中作常規(guī)石蠟切片，蘇木素－伊紅（HE）染色后鏡檢以檢測(cè)大鼠心肌組織病理學(xué)改變。

1.2.3 大鼠心肌組織Masson染色觀察左室心肌間質(zhì)纖維沉積 5μm組織切片；常規(guī)脫蠟；蘇木素染色2min，水洗；1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗10min；麗春紅酸性品紅染5min，水洗。1%磷鋁酸處理1min；2%苯胺藍(lán)染1min，1%冰醋酸浸洗1min；95%乙醇快速滴洗3次；常規(guī)脫水、透明、封片；光鏡觀察。計(jì)算心肌組織膠原纖維面積占整個(gè)組織面積的百分比，即膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）＝膠原面積／總面積，所有標(biāo)本均取3個(gè)視野測(cè)量，計(jì)算其均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用ANOVA中的q檢驗(yàn)法；計(jì)數(shù)資料采用Fisher確切概率法檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Langendorff離體心臟灌注各指標(biāo)比較 Langendorff灌注標(biāo)準(zhǔn)K－H液過(guò)程中，各組心率未見明顯差異（P＞0.05）；灌注低鉀液1～5min后各組心率有所降低。灌注低鉀液后，室性心動(dòng)過(guò)速（ventricular tachycardia，VT）、室性早搏（ventricular premature beat，PVB）出現(xiàn)時(shí)間早于短暫室顫（transient ventricular fibrillation，TVF）或持續(xù)性室顫（sustained ventricular fibrillation，SVF）。灌流低鉀液后，LVH組開始出現(xiàn)VA的時(shí)間明顯早于非LVH對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05）。隨后，LVH組出現(xiàn)SVF的時(shí)間（8min后）也明顯早于非LVH對(duì)照組和空白對(duì)照組（18min后）。LVH組的VA評(píng)分與非LVH對(duì)照組和空白對(duì)照組相比較均顯著增高（P＜0.05），見表1。

表1 Langendorff離體心臟灌注各指標(biāo)比較

續(xù)表1 Langendorff離體心臟灌注各指標(biāo)比較

2.2 大鼠心肌組織病理變化 空白對(duì)照組表現(xiàn)為大鼠左心室心肌纖維間質(zhì)和細(xì)胞形態(tài)大小接近正常，胞漿染色均勻。LVH組大鼠的心肌細(xì)胞間質(zhì)增多，心肌纖維可見溶解斷裂，細(xì)胞明顯肥大。非LVH對(duì)照組病理改變介于LVH組和空白對(duì)照組之間。

2.3 Masson染色觀察左室心肌間質(zhì)纖維沉積 LVH組心肌內(nèi)膠原組織明顯增多，圍繞心肌細(xì)胞的膠原纖維網(wǎng)斷裂、排列紊亂；空白對(duì)照組肌間隙很窄，無(wú)明顯膠原組織分布，相鄰細(xì)胞的膠原纖維網(wǎng)完好，著色淡；非LVH對(duì)照組介于LVH組和空白對(duì)照組之間。LVH組（0.30±0.05）與非LVH對(duì)照組（0.10±0.03）、空白對(duì)照組（0.08±0.03）比較，CVF明顯增高（P＜0.05），表明LVH組大鼠左心室出現(xiàn)了明顯重構(gòu)現(xiàn)象，與非LVH對(duì)照組、空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），非LVH對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

多項(xiàng)臨床研究證明，伴有LVH的高血壓患者容易引發(fā)VA，從而增加心血管事件尤其是猝死風(fēng)險(xiǎn)。Fialová等［4］對(duì)由L－NAME誘導(dǎo)的高血壓大鼠和SHR大鼠2種模型的Langendorff離體心臟灌注低鉀液后發(fā)現(xiàn)，室顫發(fā)生率均明顯高于正常對(duì)照組（83.3%vs.62.5%vs.25%～33.3%），并伴隨著連接蛋白43（Cx43）表達(dá)降低。作者由此認(rèn)為，由高血壓介導(dǎo)的縫隙連接重構(gòu)是促使惡性VA發(fā)生的重要因素，這為本研究提供了先證。

高血壓左室重構(gòu)主要表現(xiàn)為L(zhǎng)VH和心肌纖維化，而LVH即心肌細(xì)胞肥厚主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積的增大和“胎兒化表型”的出現(xiàn)。SHR大鼠的病理生理狀態(tài)與人類原發(fā)性高血壓非常接近，5～6周齡時(shí)開始逐漸出現(xiàn)血壓增高，14～16周齡時(shí)LVH已明確形成并逐漸進(jìn)展，是應(yīng)用于高血壓發(fā)病機(jī)制研究的理想動(dòng)物模型。本研究采用Langendorff低鉀液灌流對(duì)SHR大鼠以及正常大鼠的左室心肌組織進(jìn)行VA的誘發(fā)后發(fā)現(xiàn)，LVH組大鼠心肌間質(zhì)增多，心肌細(xì)胞明顯肥大。LVH組大鼠心臟在灌流低鉀液后發(fā)生各種VA的概率明顯高于非LVH對(duì)照組和空白對(duì)照組，提示K＋紊亂更容易促使LVH心肌誘發(fā)惡性心律失常，與Tribulova等［5］研究結(jié)論相一致?？赡艿臋C(jī)制為［6］：肥厚心肌增加了細(xì)胞興奮性和傳導(dǎo)性，纖維化和灶性肌溶壞死使局部心肌細(xì)胞電活動(dòng)不穩(wěn)定而產(chǎn)生折返環(huán)、室壁肥厚、耗氧量增加導(dǎo)致心肌復(fù)極的延緩及離散等。在此病理基礎(chǔ)上由低鉀液灌流引發(fā)急性電生理失衡時(shí)，細(xì)胞外K＋濃度降低，依賴于膜電位的快鈉通道失活，進(jìn)一步惡化LVH所致心肌病理改變，導(dǎo)致心肌產(chǎn)生鈣超載［7－8］。后者能夠激活Ca2＋依賴的蛋白酶Calpains而導(dǎo)致溶酶體釋放［9］，還可促使Cx43降解增加［10］。而Cx43是哺乳動(dòng)物心肌縫隙連接中主要的連接蛋白之一，其數(shù)量和分布的異常正是多種VA發(fā)生的解剖學(xué)基礎(chǔ)［11］。

另一方面，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著低鉀液灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，LVH組與非LVH對(duì)照組、空白對(duì)照組比較，大鼠離體心臟在低鉀液灌注后明顯易感惡性VA，且VA發(fā)生嚴(yán)重程度更高，起始時(shí)間更早，持續(xù)時(shí)間更久，見表1。由此說(shuō)明，LVH不僅與心血管事件密切相關(guān)，而且還可能是急慢性心血管事件（如急性低鉀血癥）引發(fā)VA的重要背景環(huán)境，甚至可能作為心血管事件重要的預(yù)測(cè)指標(biāo)。在此之前，Kannel等［12－13］就觀察到，當(dāng)個(gè)體在心臟超聲下確診LVH時(shí)，總病死率增加5倍，心血管事件病死率增加8倍，男性和女性的猝死率各增加6倍和3倍。在另一項(xiàng)多因素分析研究中［14］，有人指出男性患者左心室體積每增加50g／m2，心血管疾病死亡的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)就增加1.73，而女性數(shù)值為2.12。Martins等［15］也發(fā)現(xiàn)，將22只正常血壓和18只慢性高血壓伴有LVH的犬進(jìn)行左前降支冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)3h后，在存活下來(lái)的8只LVH犬中有7只和8只無(wú)LVH的正常血壓犬中出現(xiàn)持續(xù)性單型VA。這些研究也強(qiáng)烈支持本實(shí)驗(yàn)觀點(diǎn)。

本研究運(yùn)用Langendorff低鉀液灌流SHR大鼠LVH離體心臟模型，結(jié)果顯示伴有LVH的SHR大鼠VA的發(fā)生概率和嚴(yán)重程度較無(wú)LVH的SHR大鼠明顯增加，提示LVH與VA的發(fā)生密切相關(guān)，LVH可能正是高血壓負(fù)荷下急慢性心血管事件引發(fā)VA的必要背景環(huán)境，進(jìn)一步地確證了臨床上認(rèn)為伴有LVH的高血壓患者的VA發(fā)生率較無(wú)LVH的高血壓患者明顯增高的觀點(diǎn)，為VA發(fā)生的分子機(jī)制研究提供了可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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