翟 斡，沈一平，沈嫣婧，樓正青，丁志山

(1. 浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州 310012；2. 浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310006； 3. 杭州市中醫(yī)院，浙江 杭州 310007；4. 浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053)

小豆蔻明(cardamonin)，分子式：C16H14O4，分子量：270.28，化學結構為 2’,4’-二羥基-6’-甲氧基查爾酮，姜科植物草豆蔻中含量較多。最近有文獻報道小豆蔻明具有調節(jié)糖代謝[1]、舒張血管[2]、抗炎[3]、抗腫瘤[4-6]等作用。本文將從PTEN/PI3K/Akt通路闡述小豆蔻明誘導K562細胞凋亡機制，繼續(xù)從人慢性粒細胞白血病(CML)發(fā)病的分子水平尋找新的治療手段。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞及實驗材料

人慢性粒細胞白血病細胞株K562，由浙江省中醫(yī)院血液科實驗室提供，實驗采用對數(shù)生長期K562細胞。小豆蔻明(純度>98%)批號:110763 北京世紀奧科生物技術有限公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料公司，RPMI1640培養(yǎng)液；Trizol RNA提取試劑盒、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒、DEPC、dNTP、Random primers均為TaKaRa生物公司產品。PCR引物(由上海生工生物技術服務公司合成)：β-actin：上游5′-CAGTCCACCATCC AATGCAC-3′，下游5′-CCATCCACCT GCCTGTTGTA-3′，大小598bp。Bcl-2：上游5′-CTTCGCCGAG ATGTCCAG-3′，下游5′-GGCTCAGATAGGCA CCCA-3′，大小369 bp。Bax：上游5′-CCTTTTG CTTCAGG GTTT-3′，下游5′-TCTTCCAGATGGTGAGTGAG-3′，大小321 bp。羊抗兔二抗 批號：G130321 Epitomics，PTEN一抗批號：YH092107 Epitomics，p-Akt一抗批號：B8501ImmunoWay Biotechnology，NF-κB一抗批號：130809W博奧森生物公司，Bcl-2一抗批號：R080429華安生物公司，β-actin引物購買于華美生物工程公司。

1.2 方法

(1)細胞培養(yǎng)、配藥、加藥。將K562細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取小豆蔻明5 mg溶于1 mL的二甲基亞砜(DMSO)震蕩、配置成5 mg/mL母液。取4 μL的母液+36 μL的DMSO配置成0.5 mg/mL的工作液40 μL，96孔板中每200 μL的細胞液加入2 μL工作液，終濃度為5 μg/mL；類似方法配置藥物、加藥，加藥后各孔混勻。各組的梯度終濃度為0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL。(2)普通光鏡觀察細胞形態(tài)學。加藥后24 h，普通光鏡下觀察細胞生長狀況。(3)MTT測定生長抑制率。各組加藥后24 h、48 h、72 h，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，混勻37℃繼續(xù)孵育2 h后，離心后加入DMSO 150 μL，混勻10 min后于490 nm波長處用酶標儀測定各吸光度值(A)，按公式(生長抑制率(%)=1-實驗組A值/對照組A值 × 100%)計算抑制率。(4)細胞凋亡率檢測。收集小豆蔻明(0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)作用24 h后的細胞，PBS漂洗兩次細胞，取3×105個的細胞，按照流式試劑盒說明書加入AV、PI；15 min后于流式細胞儀檢測。(5)RT-PCR檢測相關基因的表達。收集小豆蔻明(0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)作用24 h后的細胞5×105個，提取細胞總RNA。cDNA的合成。PCR反應步驟：95℃ 3 min預變性，95℃ 5 s，60℃ 45 s，循環(huán)40次。溶解曲線分析要求95℃ 15 s，60℃ 15 s，緩慢上升至95℃ 15 s。(6)Western blot檢測相關蛋白表達。收集小豆蔻明(0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)作用24 h后的細胞3×105個，提取蛋白、配膠，電泳、轉膜、封閉、一抗、二抗雜交、顯影。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 普通光鏡觀察

小豆蔻明作用K562細胞48 h后，細胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)由圓形變?yōu)椴灰?guī)則，出現(xiàn)凋亡小體，細胞體積縮小，胞膜皺縮，不均勻，碎片逐步增多。說明K562細胞出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象，隨著小豆蔻明濃度的增加，這種凋亡現(xiàn)象更加明顯。(圖1)

A空白組圖；B小豆蔻明5μg/mL；C小豆蔻明10μg/mL；D小豆蔻明20μg/mL

2.2 MTT法檢測小豆蔻明對K562細胞的抑制率

小豆蔻明作用K562細胞24 h、48 h、72 h后，細胞出現(xiàn)不同程度的抑制作用，抑制率隨著小豆蔻明濃度及時間的增加而增加，呈現(xiàn)量效和時效關系。小豆蔻明(30 μg/mL)組增殖未見明顯增加。小豆蔻明(10 μg/mL)作用K562細胞48 h抑制率梯度明顯，故選用小豆蔻明(0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)作用K562細胞48 h為隨后實驗選用細胞，小豆蔻明作用K562細胞48 h，IC50=13.42 μg/mL(見表1，表2)。

2.3 流式結果

提示小豆蔻明(空白組(0 μg/mL)、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)處理K562細胞48 h后，K562細胞的早期凋亡率分別為(13.52±1.38)%、(19.15±2.06)%、(28.33±1.61)%左右，與空白組(凋亡率(1.4±0.6)%)均有顯著增加(P<0.05)，K562細胞表現(xiàn)出明顯的凋亡，凋亡率隨著小豆蔻明濃度的增加而增加，而且呈現(xiàn)劑量依賴關系(圖2)。

表1 小豆蔻明作用K562細胞48 h后的MTT結果分析

2.4 RT-PCR結果

RT-PCR結果表明，梯度劑量的小豆蔻明(0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)處理K562細胞48 h后，細胞內Bcl-2、Bax的mRNA表達變化明顯，Bcl-2 mRNA的表達較空白組明顯下降(P<0.05)，Bax mRNA的表達較空白組明顯升高(P<0.05)，Bax、Bcl-2的mRNA表達與小豆蔻明呈濃度依賴性(表3)。

表2 小豆蔻明(10 μg/mL)作用K562細胞不同時間的MTT結果分析

表3 小豆蔻明作用K562細胞48h后細胞內Bcl-2、Bax的mRNA表達量變化

2.5 不同濃度的小豆蔻明(0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL)處理K562細胞48 h后檢測PTEN、p-Akt、NF-κB、Bcl-2蛋白

結果提示，PTEN蛋白表達量隨小豆蔻明的濃度增加明顯增加，p-Akt、NF-κB、Bcl-2蛋白表達量隨小豆蔻明的濃度增加明顯減少(圖3)。

a空白組圖；b小豆蔻明5 μg/mL；c小豆蔻明10 μg/mL；d小豆蔻明20 μg/mL

圖3 K562細胞中PTEN, p-Akt, NF-κB, Bcl-2蛋白表達量的變化

3 討論

1977年Li等首先報道PTEN，定位于10q23.3的一種抑癌基因。在生理情況下，PTEN可以抑制Akt通路的過度活化。通過使磷脂酰肌醇D3環(huán)去磷酸化，抑制PI3K活化，負性調節(jié)PI3K/Akt/PKB通路。抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[7]。而在病理情況下，PTEN表達減弱或缺失，失去對PI3K/Akt通路的抑制作用，腫瘤發(fā)生。目前報道在大多實體瘤及骨髓瘤中PTEN 基因存在不同程度的突變或缺失。PTEN在造血系統(tǒng)疾病中的研究也逐漸增多[8]。試驗中小豆蔻明處理K562細胞48 h后檢測到PTEN蛋白表達量明顯增加，小豆蔻明具有促進抑癌蛋白量表達的作用，PTEN表達量增加進而抑制了PI3K的活化，抑制PI3K/Akt 通路的活化，促進腫瘤細胞凋亡，調節(jié)細胞增殖周期。

PTEN+PI3K/Akt是人體細胞內重要的信號轉導通路之一，廣泛參與到細胞的各項生理病理功能活動中。激活的PI3K可激活Akt，其從胞膜轉移到胞核：終止Bad對抑凋亡蛋白Bc1-2和Bcl-XL的拮抗作用；解離IκB、NF-κB二聚體，促進下游基因的表達；通過作用于P21、P27、cyclinDl調節(jié)細胞周期和增殖；作用于mTOR和P70S6K激酶通路調節(jié)細胞生長，等等。

P13K/Akt通路的活化在腫瘤發(fā)生中表現(xiàn)為抑制細胞凋亡。酪氨酸激酶、mTORC2、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、白介素-6(IL-6)等均可活化PI3K/Akt通路。活化的Akt可進一步活化下游IκBs，導致IκB從三聚體(p50、p65、IκB)中解離出來，NF-κB暴露出核內結合位點受體p50、p65，與核內的Rel類蛋白質二聚體轉錄因子結合，導致下游的基因轉錄(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、MIP-IA、ICAM-1、VCAM-1、Bcl-xl、cyclin Dl等)。同時NF-κB與Bcl-2家族基因(bcl-2、bcl-xl)上游啟動子區(qū)域(κB)位結合，抑凋亡蛋白的表達增加。

He等[9]運用小豆蔻明及類似物抑制肺腺癌細胞的NF-κB通路而促進癌細胞凋亡。秦鈾等[10]報道;小豆蔻明通過抑制骨髓瘤細胞NF-κB通路上游蛋白活性抑制NF-κB解離，抑制STAT3 通路下游的基因產物，誘導骨髓瘤細胞凋亡。本實驗中小豆蔻明處理K562細胞后，抑制了Akt的活化，p-Akt蛋白量減少，減少了IκB的活化，抑制NF-κB從三聚體(p50、p65、IκB)中解離，減少了下游抑凋亡蛋白的表達，及一些具有導致細胞分裂周期失衡，增殖過度活躍作用的細胞因子的表達釋放。促進腫瘤細胞的凋亡。

活化的Akt可以進一步活化胞漿中促凋亡蛋白(Bax、Bad等)，釋放抗凋亡蛋白，增加胞漿中游離的抗凋亡蛋白(Bcl -2、Bcl-XL等)的量。Bad廣泛存在于線粒體外膜上。靜息狀態(tài)Bad、Bax可與Bcl-2形成復合體，具有促進凋亡作用[11]。活化的Akt可以磷酸化Bad，活化的Bad就脫離了其與Bcl-2形成二聚體復合物，僅僅Bad是不能促進細胞凋亡的，此時胞漿中存在大量游離的抗凋亡因子Bcl-2，進而起到抑制細胞凋亡的作用，小豆蔻明處理K562細胞后，抑制Akt的活化，導致Bad與Bcl-2形成復合體，減少胞漿中游離抑凋亡蛋白Bcl-2表達量，RT-PCR提示同時Bcl-2基因的表達量減少與NF-κB抑制Bcl-2家族基因(Bcl -2、Bcl-XL)的表達有關。即減少胞漿中游離的Bcl-2蛋白，又減少了Bcl-2基因的翻譯。從而使小豆蔻明達到促進K562細胞凋亡的作用。

舒向榮等[12]報道;在分子水平證實小豆蔑明通過caspase和PARP活化途徑誘導骨髓微環(huán)境中MM細胞的調亡機制。也有文獻[13-15]報道小豆蔻明通過抑制mTOR及其下游蛋白而抑制細胞的增殖及新生血管的生成。小豆蔻明抗腫瘤是多重效應的，還要繼續(xù)從分子層面深入研究小豆蔻明抗腫瘤機制。深入研究慢性粒細胞性白血病的發(fā)病機制。為小豆蔻明的動物及臨床試驗做鋪墊。

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