周 震，王雪巖，王 坤，王 凱，張玉蓮

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

腦梗死又稱缺血性卒中，本病系由各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進(jìn)而產(chǎn)生臨床上對(duì)應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)，在整個(gè)卒中中占很大比例[1]。腦梗死依據(jù)發(fā)病機(jī)制的不同分為腦血栓形成、腦栓塞和腔隙性腦梗死等主要類型。其中腦血栓形成是腦梗死最常見的類型，約占全部腦梗死的60%[2]，因而通常所說(shuō)的“腦梗死”實(shí)際上指的是腦血栓形成，迅速溶栓，恢復(fù)血流是最基本、最有效的方法[3]。隨著我國(guó)人民生活水平的不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)、生活方式和疾病譜逐漸發(fā)生變化，青年腦梗死患病率有逐年上升的趨勢(shì)[4]，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。為探索血栓性疾病的原因、病理生理變化,開展新療法,預(yù)測(cè)臨床轉(zhuǎn)歸，動(dòng)物模型的建立是不可缺少的手段，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)不同方法建立了多種MCAO模型[5]，本文在Busch[6]，張新江等[7]的實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上對(duì)模型做了進(jìn)一步改良，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康SD大鼠33只，為保耐受度與均衡度，全部選用雄鼠，體重200 g左右，SPF級(jí)，來(lái)源于北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2009-0004】，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所飼養(yǎng)【SYXK(津)2011-0008】，分為三組，其中對(duì)照組3只、普通手術(shù)組15只，改良手術(shù)組15只。實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的操作符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

麻藥(10%水合氯醛)，2, 3, 5 -氯化三苯基四氮唑( triphenyl tetrazolium chloride, TTC，Sigma)毛細(xì)玻璃管(0.5 mm)，凝血酶，刀片(普通吉列剃須刀片)，手術(shù)器材(手術(shù)剪一個(gè)，彎頭鑷子兩個(gè)，縫合針，縫合線)，5.5號(hào)靜脈輸液針，動(dòng)脈夾，載玻片，離心管，碘伏，慶大霉素。

1.3 栓子制備

取健康大鼠一只進(jìn)行內(nèi)眥取血0.5 mL，立即注入含有0.75 μL檸檬酸鈉(0.109 mol/L)的EP管內(nèi)，混勻后5000 r/min離心1 min。取貧血小板血漿160 μL，RBC 10 μL與1單位凝血酶(25萬(wàn)單位/L)、30 μL氯化鈣(0.5 mol/L)溶液混合，立即將其吸入毛細(xì)玻璃管中。為確保血凝的質(zhì)量，取完血的毛細(xì)玻璃管平放，靜置2 min。2 min后，用生理鹽水浸潤(rùn)后將毛細(xì)玻璃管從中間掰斷，并在保持血栓不被拉斷的情況下輕輕至于載玻片上，載玻片上的所有操作要確保在生理鹽水的浸潤(rùn)下進(jìn)行。輕輕將所有的血栓全部拉出，最后用刀片將血栓切成1～1.5 mm大小的栓子，放在盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中備用。

1.4 模型制備

注：CCA=頸總動(dòng)脈，ICA=頸內(nèi)動(dòng)脈，MCA=大腦中動(dòng)脈，PCA=大腦后動(dòng)脈，ECA=頸外動(dòng)脈，PPA=翼腭動(dòng)脈，ACA=大腦前動(dòng)脈。

改良手術(shù)組：采用10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉后，頸正中切開皮膚，剝離肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌與胸骨乳突肌，暴露頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA)與頸外動(dòng)脈(ECA)。分離左側(cè)ECA與ICA[3-4]。游離ECA遠(yuǎn)端并結(jié)扎之，凝閉其分支，并再次在ECA下穿過(guò)縫合線，備用。用金屬動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉CCA，用5.5號(hào)靜脈輸液針逆行穿刺左側(cè)ECA至CCA，稍過(guò)ICA起始處，然后用穿過(guò)備用的縫合線扎緊，隨即用1 mL注射器緩慢推注栓子鹽水懸液直至所用栓子全部進(jìn)入CCA，撤出輸液針的同時(shí)扎緊進(jìn)針孔。撤去動(dòng)脈夾后恢復(fù)ICA的血供，使栓子通過(guò)ICA，在動(dòng)脈血恢復(fù)的瞬間沖擊下進(jìn)入顱內(nèi)至大腦中動(dòng)脈，縫合皮膚。肌注慶大霉素(0.5 mL/只)以抗感染。假手術(shù)組手術(shù)方法同模型制作，只在注射時(shí)以等量生理鹽水代替栓子溶液(見圖1)。

普通手術(shù)組：在注入栓子之前結(jié)扎翼腭動(dòng)脈，其余方法同改良手術(shù)組。

1.5 模型評(píng)價(jià)

1.5.1 動(dòng)物蘇醒后按Bederson評(píng)分[9]：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀為0分；懸尾實(shí)驗(yàn)不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪為1分；前肢抵抗對(duì)側(cè)推力能力下降為2分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為3分。

表1 Bederson評(píng)分

表2 梗死灶體積

1.5.2 手術(shù)24 h后斷頭取材，完整剝離大鼠全腦，﹣80℃冰凍5 min，至于腦槽上切片后行TTC染色，計(jì)算梗死區(qū)體積。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 Bederson 評(píng)分

與對(duì)照組比較，兩個(gè)手術(shù)組評(píng)分均明顯升高，說(shuō)明兩個(gè)手術(shù)組均出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷，兩個(gè)手術(shù)組之間比較，沒(méi)有表現(xiàn)出明顯差異(P> 0.05)。

2.2 梗死灶的體積

手術(shù)24 h后TTC染色見普通手術(shù)組與改良手術(shù)組均出現(xiàn)白色壞死區(qū)域，并且兩組梗死體積相差不大(P> 0.05)，對(duì)照組無(wú)白色梗死區(qū)出現(xiàn)(圖2)。

3 討論

3.1 關(guān)于PPA的結(jié)扎問(wèn)題

在以往的實(shí)驗(yàn)研究中實(shí)驗(yàn)者傾向于將同側(cè)翼腭動(dòng)脈(PPA)同時(shí)結(jié)扎[10]，但是PPA的位置特別深，大約在ICA與ECA分叉上1～1.5 cm處，實(shí)驗(yàn)操作中不容易分離及操作，同時(shí)也因?yàn)樗荌CA的分支，并且直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于ICA，所以本實(shí)驗(yàn)通過(guò)控制栓子的大小而不需要結(jié)扎來(lái)避免栓子通過(guò)PPA。通過(guò)實(shí)際試驗(yàn)操作及結(jié)果來(lái)看，不接扎PPA并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.2 關(guān)于不同體重大鼠的選擇問(wèn)題

大鼠的重量是影響本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)關(guān)鍵因素。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，體重過(guò)大的大鼠ECA及CCA過(guò)于粗壯，栓子不容易造成梗塞，體重過(guò)小又不利于針頭穿刺進(jìn)入CCA進(jìn)行栓子注入，所以選擇大鼠時(shí)控制體重在200 g左右。

3.3 關(guān)于栓子的制備問(wèn)題

栓子的大小要嚴(yán)格控制在1～1.5 mm之間，因?yàn)樘〉乃ㄗ硬荒艽_保大于PPA的直徑，從而有從PPA通過(guò)的可能，太大的栓子不容易從5.5號(hào)靜脈輸液針頭通過(guò)，容易堵塞針頭而影響注射。其次，將栓子吸入5 mL注射器時(shí)應(yīng)先將針頭拔下再吸入，不可用針頭直接吸入，這樣避免了吸入率低及容易產(chǎn)生氣泡等問(wèn)題。栓子吸入以后先將輸液針管內(nèi)注滿生理鹽水然后靠栓子重力緩慢滑至針頭尾端，并且保證每個(gè)栓子之間有一定距離從而使它們依次被注入血管。

3.4 關(guān)于ECA結(jié)扎問(wèn)題

遠(yuǎn)端結(jié)扎線盡量靠上，留出足夠的空間進(jìn)行針尖穿刺；近端結(jié)扎線盡量靠近分叉口，可以防止栓子流回ECA。

3.5 關(guān)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果問(wèn)題

通過(guò)最后對(duì)大鼠形態(tài)的評(píng)分比較及TTC染色可以明顯體現(xiàn)兩個(gè)手術(shù)組與對(duì)照組的區(qū)別(P< 0.05)，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有意義；并且兩個(gè)手術(shù)組之間沒(méi)有明顯差別(P< 0.05)

3.6 關(guān)于本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)問(wèn)題

本實(shí)驗(yàn)沿用張新江等[11]的栓子制備方法，可造成MCAO的同時(shí)而不發(fā)生自溶，并且易被溶栓劑溶解。同時(shí)由于控制了栓子大小的前提下，開放PPA不接扎，并且在注入栓子的操作中，用普通輸液針頭代替留置針，采用雙線分段結(jié)扎，動(dòng)脈夾單獨(dú)夾閉CCA的方法，使得實(shí)驗(yàn)更簡(jiǎn)便易行，節(jié)省操作時(shí)間，降低手術(shù)死亡率。

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