胡培麗，羅飛亞，陳志蓉, 邢書(shū)霞

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

皮膚致敏繼而導(dǎo)致接觸過(guò)敏性皮炎是一種有關(guān)職業(yè)衛(wèi)生及消費(fèi)者健康的重要問(wèn)題，評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)及產(chǎn)品的皮膚致敏性可以有效地防止接觸過(guò)敏性皮炎的發(fā)生。小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(local lymph node assay, LLNA)是目前檢測(cè)化學(xué)物致敏性的最新替代方法，該方法減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，靈敏快速，結(jié)果客觀敏感，已被歐洲經(jīng)濟(jì)發(fā)展與合作組織(organization for economic co-operation and development, OECD)、歐洲替代試驗(yàn)驗(yàn)證中心(european center for the validation of alternative method, ECVAM)、美國(guó)環(huán)保署(United States Environmental Protection Agency, USEPA)和中國(guó)等采納為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法[1-4]。但該方法需要使用放射性標(biāo)記物、特定的設(shè)備和實(shí)驗(yàn)條件，不利于推廣。TAKEYOSHI等[5-6]建立了基于摻入溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)的LLNA方法，已通過(guò)實(shí)驗(yàn)室間認(rèn)證并于2010年被歐洲經(jīng)濟(jì)發(fā)展與合作組織(OECD)采納[7]。目前我國(guó)該方法的相關(guān)研究報(bào)道還較少，本研究旨在建立一種可快速檢測(cè)化學(xué)物致敏性和刺激性的LLNA:BrdU-ELISA改良法，從而進(jìn)一步評(píng)價(jià)化妝品產(chǎn)品。

1 材料和方法

1.1 受試物

AOO 溶劑：由丙酮：橄欖油=4:1(v/v)配制而成，致敏陽(yáng)性劑：2,4二硝基氯苯(DNCB，中國(guó)醫(yī)藥總公司北京分公司)，用AOO配成0.1% (w/v)、0.3% (w/v)、1.0% (w/v) 3個(gè)濃度；丁子香酚(EUG, Sigma公司)，己基肉桂醛(HCA, Sigma公司)，均用AOO配制成25% (v/v)和50% (v/v) 2個(gè)濃度；3種化妝品原液直接涂抹于小鼠耳背皮膚。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠，雌性，8～10周齡，由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心【SCXK(京)2009-0017】。動(dòng)物試驗(yàn)環(huán)境條件為屏障系統(tǒng)動(dòng)物房【SYXK(京)2011-0008】，溫度22±2℃，濕度50%～70%，動(dòng)物自由飲食，12 h人工照明。

1.3 試劑和儀器

BrdU-ELISA試劑盒、BrdU粉劑均購(gòu)自德國(guó)Roche公司(編號(hào)11647229001、10280879001)。BrdU標(biāo)記液用生理鹽水配制成濃度10 mg/mL。CR22G III型低溫離心機(jī)(日本HitacHi公司)、SYNERGY HT型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO TEK 公司)，千分尺(Mitutoyo 公司)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組和染毒[7-8]

動(dòng)物隨機(jī)分組，每組4只小鼠，分別設(shè)溶劑對(duì)照組(AOO/蒸餾水)、陽(yáng)性對(duì)照組(2,4二硝基氯苯、己基肉桂醛、丁子香酚)和3種化妝品。將受試物25 μL/耳/d，連續(xù)3 d涂抹于小鼠雙耳背部皮膚，溶劑對(duì)照組涂抹相應(yīng)的溶劑，第4天不處理，第5天腹腔注射0.5 mL BrdU標(biāo)記液，第6天分離耳部淋巴結(jié)。

1.4.2 耳緣厚度測(cè)量

分別于首次給藥前和末次給藥后約24 h，用千分尺測(cè)量小鼠耳緣厚度，第6天處死動(dòng)物后，取小鼠耳緣直徑9 mm的組織稱(chēng)重。

1.4.3 淋巴細(xì)胞懸液的制備

腹腔注射BrdU標(biāo)記液后24 h處死動(dòng)物，摘取小鼠耳部淋巴結(jié)，用萬(wàn)分之一天平稱(chēng)重，在PBS中研磨，200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，用PBS洗2次，離心(1200 r/min, 8 min)，將每只小鼠的淋巴細(xì)胞定容于14 mL PBS中。

1.4.4 ELISA檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖

將細(xì)胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，100 μL/孔，1400 r/min 離心10 min，棄上清，吹干細(xì)胞。用ELISA試劑盒檢測(cè)BrdU值：每孔加200 μL變性固定液，常溫放置30 min, 輕拍完全后棄去變性液；加入100 μL抗-BrdU抗體工作液，常溫孵育90 min;棄去未結(jié)合的抗體工作液，加入240 μL PBS洗液，洗3次，輕拍去除洗液；加底物顯色液100 μL、常溫孵育20 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A)值(發(fā)射波長(zhǎng)和參考波長(zhǎng)分別為370 nm，492 nm)，BrdU標(biāo)記指數(shù)為(A370-A空白370)-(A492-A空白492)。

1.4.5 SI、EC1.6的計(jì)算與致敏性分級(jí)

刺激指數(shù)( stimulation index，SI)是受試物組與溶劑對(duì)照組的比值，即SI=受試物組BrdU標(biāo)記指數(shù)均值/溶劑對(duì)照組BrdU標(biāo)記指數(shù)均值；SI≥1.6，該受試物為致敏陽(yáng)性，但對(duì)于SI為 1.6～1.9的邊緣結(jié)果，仍需考慮劑量-效應(yīng)關(guān)系、系統(tǒng)性毒性或過(guò)度刺激等癥狀[7-8]。根據(jù)SI值計(jì)算EC1.6，即SI等于1.6時(shí)受試物的濃度，并根據(jù)EC1.6值進(jìn)行致敏級(jí)別判定。計(jì)算公式為：①EC1.6=c+[(1.6-d)/(b-d)]×(a-c)(受試物各濃度組對(duì)應(yīng)SI值包括>1.6和<1.6)，②EC1.6=2^{log2(c)+[(1.6-d)/(b-d)]×[log2(a)-log2(c)]}(受試物各濃度組對(duì)應(yīng)SI值均>1.6)，其中設(shè)a、c為鄰近兩點(diǎn)受試物的濃度，b、d為對(duì)應(yīng)的SI值；當(dāng)SI=1.6時(shí)，其對(duì)應(yīng)的受試物濃度即為EC1.6值[8]。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：EC1.6<0.1極強(qiáng)，0.1≤EC1.6<1.0強(qiáng)，1.0≤EC1.6<10中,10≤EC1.6<100弱[8]。

1.4.6 LLNA:BrdU-ELISA法結(jié)果與文獻(xiàn)、經(jīng)典動(dòng)物法比較

2,4二硝基氯苯、丁子香酚和己基肉桂醛的檢測(cè)結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)比較，3種化妝品同時(shí)進(jìn)行豚鼠局部封閉涂皮試驗(yàn)(BT)和家兔多次皮膚刺激性試驗(yàn)[9]，將數(shù)據(jù)與本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 染毒期間動(dòng)物狀態(tài)觀察

染毒期間動(dòng)物飲食正常，體重增長(zhǎng)良好。部分組別小鼠染毒部位見(jiàn)有水腫、紅斑或結(jié)痂刺激性或致敏性癥狀，各臟器未見(jiàn)有任何病變，未觀察到明顯的其他毒性情況。

2.2 LLNA:BrdU-ELISA法測(cè)定結(jié)果

由表1可見(jiàn)刺激性指標(biāo)：DNCB(1.0%)、HCA(25%、50%)和3號(hào)粉底霜的耳腫脹和耳廓重顯著增加(P< 0.05或P< 0.01)，判斷可能為刺激物；其他組與對(duì)照組比較(DNCB、EUG與AOO組比較，1、2號(hào)精華霜與蒸餾水組比較)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。

由表2可見(jiàn)致敏性指標(biāo)：3種化學(xué)物(所有濃度)淋巴結(jié)重量與AOO組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)；3號(hào)粉底霜淋巴結(jié)重量與蒸餾水組比較顯著增加(P< 0.01)；SI均大于1.6(1.9)。1、2號(hào)精華霜組淋巴結(jié)重量與蒸餾水組比較無(wú)明顯差異(P> 0.05)，且SI均小于1.6。致敏性分級(jí)結(jié)果為：DNCB為極強(qiáng)致敏物，EUG和HCA為中等強(qiáng)度致敏物。

2.3 LLNA:BrdU-ELISA法、BT法與多次皮膚刺激性試驗(yàn)法對(duì)3種化妝品的致敏性和刺激性檢測(cè)結(jié)果

由表3可見(jiàn),1、2號(hào)精華霜試驗(yàn)結(jié)果均為無(wú)刺激性、無(wú)致敏性；3號(hào)粉底霜LLNA:BrdU-ELISA法結(jié)果為有刺激性和致敏性，多次皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果為有刺激性，BT試驗(yàn)結(jié)果為無(wú)致敏性。

表1 3種化學(xué)物和3種化妝品的皮膚刺激性檢測(cè)結(jié)果表

表2 3種化學(xué)物和3種化妝品的皮膚致敏性檢測(cè)結(jié)果表

表3 LLNA:BrdU-ELISA法、BT法與皮膚刺激性試驗(yàn)法對(duì)3種化妝品的皮膚刺激性和致敏性檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前國(guó)內(nèi)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中關(guān)于化妝品致敏性的檢測(cè)方法是豚鼠最大值試驗(yàn)(GPMT)及局部封閉涂皮試驗(yàn)(BT)，但檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、動(dòng)物數(shù)量多、結(jié)果評(píng)判主觀性強(qiáng)[9]。隨著新型化妝品、日用物品等新型化學(xué)合成物大量上市，開(kāi)發(fā)可靠的動(dòng)物替代實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估化學(xué)物毒性迫在眉睫。小鼠局部淋巴結(jié)法(LLNA)用小鼠代替豚鼠，動(dòng)物量少，檢驗(yàn)周期減短，同時(shí)可定量檢測(cè)受試物致敏性，結(jié)果客觀。近來(lái)國(guó)內(nèi)也有些關(guān)于LLNA方法的研究報(bào)道，如放射法，或用MTT、BrdU替代等[10-13]。本研究建立的LLNA:BrdU-ELISA改良法，可用于全面評(píng)價(jià)化學(xué)物、化妝品原料及產(chǎn)品的皮膚刺激性和致敏性。

國(guó)際上有研究發(fā)現(xiàn)，刺激物和致敏物均可對(duì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生增殖作用，從而致使LLNA產(chǎn)生假陽(yáng)性[14-15]。目前有研究通過(guò)分析淋巴細(xì)胞B220+、CD3+、CD4+表型增強(qiáng)LLNA方法的特異性[16-18]，也有增選刺激性指標(biāo)(耳厚差、耳重)對(duì)化學(xué)物的致敏性和刺激性進(jìn)行評(píng)價(jià)[19-22]。本研究不僅對(duì)淋巴結(jié)重量、刺激指數(shù)(SI)和EC值等致敏性指標(biāo)進(jìn)行分析，同時(shí)還測(cè)量耳厚差和耳重刺激性指標(biāo)，從而全面評(píng)價(jià)化學(xué)物的刺激性和致敏性；但是致敏假陽(yáng)性仍需通過(guò)細(xì)胞分型等技術(shù)進(jìn)一步判定；此外一些含有特殊結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)影響該方法的識(shí)別能力，從而干擾方法的準(zhǔn)確性，需用傳統(tǒng)的豚鼠試驗(yàn)評(píng)價(jià)其致敏性[7]。

3.1 3種化學(xué)物與有關(guān)文獻(xiàn)的比較

2,4二硝基氯苯(DNCB)、丁子香酚和己基肉桂醛均是已知的皮膚致敏物[7-8]，本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)LLNA檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，根據(jù)EC1.6值致敏性分級(jí)與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。高劑量DNCB和HCA可引起小鼠耳部皮膚紅腫或結(jié)痂，耳緣厚度與耳重明顯增加(P< 0.05)，表明高劑量DNCB(1%)和HCA(25%、50%)對(duì)皮膚有刺激性，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。

3.2 LLNA: BrdU-ELISA法、BT法與皮膚刺激試驗(yàn)法對(duì)3種化妝品的致敏性和刺激性檢測(cè)結(jié)果

1、2號(hào)精華霜BT法與皮膚刺激試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果均為無(wú)刺激性、無(wú)致敏性，結(jié)果與LLNA法一致。3號(hào)粉底霜BT法與皮膚刺激試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為有刺激性、無(wú)致敏性，但LLNA法結(jié)果為有刺激性和致敏性，致敏性判斷不一致，我們分析其中的可能原因?yàn)椋?1)BT試驗(yàn)中陽(yáng)性致敏物DNCB的誘導(dǎo)濃度為3%，激發(fā)濃度為1.5%；而LLNA方法0.1% DNCB即可使小鼠淋巴細(xì)胞明顯增殖(P< 0.05)，表明LLNA方法對(duì)化學(xué)物的致敏性判斷可能更靈敏，這與有關(guān)報(bào)道一致[20]；(2)刺激性引起淋巴細(xì)胞增殖從而導(dǎo)致的致敏假陽(yáng)性，有待于進(jìn)一步分析淋巴細(xì)胞表型，值得深入研究。

綜上，LLNA: BrdU-ELISA改良法操作簡(jiǎn)單、快速，結(jié)果客觀，可較好地評(píng)價(jià)化學(xué)物和化妝品產(chǎn)品的皮膚刺激性和致敏性，有望在化妝品安全性評(píng)價(jià)中推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1] OECD. OECD guideline for the testing of chemicals No. 429: Skin sensitisation: Local lymph node assay[S]. OECD Paris, 2002. http://www.oecd.org/env/ehs/testing/45124696.pdf.

[2] McGarry HF.The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH[J]. Toxicology, 2007, 238 (2): 71-89.

[3] United States Environmental Protection Agency (USEPA)．Heath effects test guidelines, OPPTs 870, 2600: skin sensitization[S]. USA: EPA, 2003．

[4] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)．GB/T 21827-2008 化學(xué)品皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)局部淋巴結(jié)方法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008．

[5] Takeyoshi M, Yamasaki K, Yakabe Y,etal. Development of non-radio isotopic endpoint of murine local lymph node assay based on 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) incorporation [J]. Toxicology letters, 2001, 119(3): 203-208.

[6] Takeyoshi M, Sawaki M, Yamasaki K,etal. Assessment of statistic analysis in non-radioisotopic local lymph node assay (non-RI-LLNA) with α-hexylcinnamic aldehyde as an example[J]. Toxicology, 2003, 191(2): 259-263.

[7] OECD.OECD guideline for the testing of chemicals No. 442B: Skin sensitization: Local lymph node assay: BrdU-ELISA [S]. OECD Paris, 2010. http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/suppdocs/feddocs/oecd/oecd-tg442b.pdf.

[8] ICCVAM. Test Method Evaluation Report: The Murine Local Lymph Node Assay: BrdU-ELISA, a Nonradioactive Alternative Test Method to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products [R]. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. NIH Publication, 2010. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm.

[9] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 化妝品衛(wèi)生規(guī)范[S]. 北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2007: 102-105.

[10] 劉協(xié)，呂中明，施偉慶，等．BALB/c和ICR小鼠用于局部淋巴結(jié)試驗(yàn)的研究[J]. 江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué), 2009, 20(1): 4-6．

[11] 王宗惠，劉怡娜，蘇英，等．一種改進(jìn)的局部淋巴結(jié)試驗(yàn)-噻唑藍(lán)法[J]．毒理學(xué)雜志，2003, 17(4): 257-258.

[12] 高珊, 馬玲, 童英, 等. 小鼠局部淋巴結(jié)分析試驗(yàn)替代豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)[J]. 毒理學(xué)雜志, 2010, 24(4): 297-299.

[13] 何國(guó)群，楊杏芬，鄭穗生，等. 溴脫氧尿嘧啶核苷摻入法作為皮膚致敏試驗(yàn)替代方法研究[J]. 中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué), 2011,38(5): 377-380.

[14] Kirk M K, Broomhead Y, DiDonato L,etal. Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances [J]. SOT Congrees 2007, 2007: 1896-1904.

[15] Sailstad D M. Murine local lymph node assay: An alternative test method for skin hypersensitivity testing [J]. Lab animal, 2002, 31(7): 36-41.

[16] Jung K M, Jang W H, Lee Y K,etal. B cell increases and ex vivo IL-2 production as secondary endpoints for the detection of sensitizers in non-radioisotopic local lymph node assay using flow cytometry [J]. Toxicology letters, 2012, 209(3): 255-263.

[17]. Anderson S E, Umbright C, Sellamuthu R,etal. Irritancy and allergic responses induced by topical application of ortho-phthalaldehyde [J]. Toxicological Sciences, 2010, 115(2): 435-443.

[18]. Lv L, Yan G Y, Zhao Y L,etal. Investigation of the dermal sensitizing potential of traditional medical extracts in local lymph node assays [J]. Experimental Biology and Medicine, 2009, 234(3): 306-313.

[19] 陽(yáng)曉燕, 趙康峰, 孔建, 等. 局部淋巴結(jié)改良法在化妝品皮膚刺激性和致敏性檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2013, 30 (4): 312-316.

[20] Ehling G, Hecht M, Heusener A,etal. An European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round [J]. Toxicology, 2005, 212(1): 60-68.

[21] Hans-Werner V, Jürgen A H. The local lymph node assay being too sensitive? [J]. Archives of toxicology, 2005, 79(12): 721-728.

[22] Homey B, von Schilling C, Blümel J,etal. An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions [J]. Toxicology and applied pharmacology, 1998, 153(1): 83-94.