高 倩，李 蔓，張萬(wàn)山，魏守剛

(1.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)系，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)，環(huán)境毒理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

肥胖癥已成為世界范圍內(nèi)危害人體健康、影響生命質(zhì)量、增加社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)的現(xiàn)代流行性疾病[1]。鐵是人體一種必需微量元素，鐵缺乏可造成免疫損傷，運(yùn)動(dòng)能力下降等危害。近年來(lái)的許多研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者比正常體重人群更易發(fā)生鐵缺乏[2]。肥胖與鐵缺乏集于一身，將對(duì)機(jī)體帶來(lái)雙重危害，嚴(yán)重影響人體尤其是兒童的健康。一些研究表明，肥胖兒童鐵的需要量并無(wú)增加，膳食鐵的攝入量和生物利用度也不低[3]，肥胖兒童對(duì)穩(wěn)定性同位素示蹤鐵的膳食吸收率顯著低于正常對(duì)照兒童[4]，提示我們膳食鐵吸收不良是導(dǎo)致肥胖性鐵缺乏發(fā)生的原因。十二指腸是鐵吸收的主要部位，十二指腸中有兩種主要鐵吸收分子即二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(divalent metal transporter 1,DMT1)和膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferroportin 1,FPN1)對(duì)鐵的吸收發(fā)揮起直接調(diào)控作用。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)肥胖對(duì)腸鐵吸收影響機(jī)制的研究較少，相關(guān)鐵吸收分子在肥胖機(jī)體內(nèi)如何調(diào)節(jié)鐵的吸收尚不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)以高脂膳食建立小鼠肥胖模型，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法分析營(yíng)養(yǎng)性肥胖對(duì)小鼠十二指腸DMT1、FPN1mRNA及蛋白表達(dá)的影響，初步探討肥胖影響鐵吸收的機(jī)制，為今后有效預(yù)防和治療肥胖性鐵缺乏提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組及處理

4周齡雌性C57BL/6J小鼠12只，體重10～13 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(軍)2012-0004】。動(dòng)物飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(京)2010-0022】。以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為2組，即正常對(duì)照組和肥胖模型組，每組6只。對(duì)照組小鼠繼續(xù)飼以普通飼料，模型組飼以經(jīng)輻照消毒的特制高脂鼠料，配方為基礎(chǔ)飼料79%、豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇1%(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，飼養(yǎng)期14周，每周測(cè)體重1次。

飼養(yǎng)建模結(jié)束后，用10%水合氯醛按400 mg/kg體重腹腔注射麻醉小鼠，開(kāi)腹剪取十二指腸，液氮中速凍保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)許可。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)DMT1、FPN1 mRNA含量

取凍存十二指腸組織100 mg，Trizol法提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量260 nm、280 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，計(jì)算A260/A280和RNA濃度。取5 μL RNA進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA的完整性。參照DNase Ⅰ試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)對(duì)RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理，在2 μg總RNA樣本中加入DNase I 2 μL，10×緩沖液2 μL，無(wú)RNase水至20 μL，37℃孵育30 min后，加入2 μL 200 mmol/L EDTA終止反應(yīng)，65℃孵育10 min。處理后的總RNA樣品用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(北京康為)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA合成反應(yīng)體系(20 μL)：2 μL Primer mix(Oligo dT引物，隨機(jī)引物)，5×緩沖液4 μL，0.1 mmol/L DTT 2 μL，10 mmol/L dNTP 1μL，消化后的RNA 10 μL，200 μmol/L HiFi-MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，加無(wú)RNase水至20 μL。反應(yīng)條件: 37℃孵育50 min，70℃孵育10 min。反應(yīng)產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存。

用熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)按照Ultra SYBR Mixture PCR 試劑盒(北京康為)進(jìn)行擴(kuò)增。目的基因和內(nèi)參基因的引物序列如下：(1)DMTI 上游5′-GCGCTCTTTGTTTCCTTCAT-3′，下游5′-TTGTCACTGGGAAAGAGGTC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度140 bp；(2)FPN1上游5′-CCCTTCCGC ACTTTCCGAAT-3′，下游5′- GAGAATAGACC AGTCCGAACAAGGC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度257 bp；(3)β-actin上游5′-GCCTTCCTTCTTGGGTAT-3′，下游5′-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度97 bp。20 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系包括: 2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，0.4 μL上游引物10 μmol/L，0.4 μL下游引物10 μmol/L，2 μL cDNA 10 μmol/L，加入滅菌蒸餾水至20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min，(95℃ 15 s，60℃ 60 s)×45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品同時(shí)做3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)結(jié)果按照2-ΔΔCt相對(duì)定量公式計(jì)算即ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組，將對(duì)照組小鼠mRNA表達(dá)水平定為1，分析模型組和對(duì)照組不同基因表達(dá)的差異。

1.3 Western blot法檢測(cè)FPN1蛋白的表達(dá)

應(yīng)用RIPA試劑提取組織蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白質(zhì)采用12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至NC膜，麗春紅染膜。室溫封閉(3%BSA，TBST稀釋)30 min，然后加入兔抗FPN1多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司，1∶2000)，4℃過(guò)夜。次日TBST洗膜后加入1:5000 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)抗體(北京天德悅生物科技有限公司)，室溫?fù)u動(dòng)孵育40 min。使用ECL試劑盒發(fā)光顯影，膠片曝光。以GAPDH作為內(nèi)參，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。膠片曝光結(jié)果掃描輸入計(jì)算機(jī)后，用TotalLab Quant凝膠成像分析軟件分析處理，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的積分光密度(integral optical density，IOD)比值表示相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肥胖模型的構(gòu)建情況

自喂養(yǎng)干預(yù)第3周，肥胖模型組小鼠體重增長(zhǎng)量開(kāi)始超出對(duì)照組，至第14周末，模型組和對(duì)照組小鼠平均體重分別為32.34±1.24 g和23.67±0.96 g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)肥胖度計(jì)算公式計(jì)算模型組每只小鼠的肥胖度：肥胖度(%)=(模型組實(shí)際體重-對(duì)照組平均體重) /對(duì)照組平均體重×100，結(jié)果模型組所有小鼠體重均超過(guò)對(duì)照組小鼠平均體重的20%，其中體重最輕的小鼠肥胖度為28.43%，表明小鼠肥胖模型建立成功。模型組和對(duì)照組小鼠各周平均體重(表1)。

表1 不同組小鼠各周平均體重的情況(單位：g)

2.2 十二指腸DMT1、FPN1 mRNA表達(dá)水平

十二指腸樣本中提取RNA的A260/A280均在1.9～2.1，說(shuō)明提取的RNA純度較高。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，圖1可見(jiàn)28S、18S和5S rRNA 3條帶，其中前兩條帶的相對(duì)亮度為2∶1，說(shuō)明RNA完整性好，無(wú)明顯降解。

注：A、B、C：對(duì)照組樣本，D、E、F：模型組樣本。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，目的基因DMT1、FPN1和內(nèi)參基因β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.997，擴(kuò)增效率在99%～105%之間。融解曲線呈單峰，各基因均為特異性擴(kuò)增。統(tǒng)計(jì)分析顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠DMT1、FPN1mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)(圖2)。

注：* 與對(duì)照組比較P < 0.05。

2.3 十二指腸FPN1蛋白的表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3所示：模型組小鼠十二指腸FPN1蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，其相對(duì)表達(dá)量分別為0.54±0.13和0.76±0.12，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。

注：* 與對(duì)照組比較P < 0.05。

3 討論

肥胖動(dòng)物模型是研究肥胖及其相關(guān)疾病的主要工具[5]，以與人類肥胖最為接近高脂飼料所致的單純性肥胖模型應(yīng)用最為廣泛，由于C57BL/6J小鼠對(duì)高脂飲食較為敏感，國(guó)外很多肥胖相關(guān)的研究選用C57BL/6J小鼠進(jìn)行[6-7]。因此，本研究選擇C57BL/6J小鼠作為研究對(duì)象，采用飲食誘導(dǎo)方式建立肥胖模型，模型組小鼠平均體重高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明成功構(gòu)建肥胖小鼠模型。

腸鐵吸收和釋放主要依賴于腸上皮細(xì)胞的鐵吸收蛋白的介導(dǎo)，食物中的三價(jià)鐵離子首先被位于十二指腸刷狀緣上的游離還原劑還原成二價(jià)鐵離子，然后由位于刷狀緣上的DMT1將其轉(zhuǎn)運(yùn)至腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在上皮細(xì)胞內(nèi)一部分鐵以鐵蛋白的形式儲(chǔ)存在鐵池內(nèi)，另一部分鐵被亞鐵氧化酶氧化為高鐵后,通過(guò)基底膜上的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)分子FPN1的介導(dǎo)，穿過(guò)上皮細(xì)胞的基底端細(xì)胞膜被運(yùn)載出細(xì)胞,進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，滿足機(jī)體對(duì)鐵的需要。機(jī)體主要通過(guò)控制近端小腸的鐵吸收量和鐵釋放量以達(dá)到鐵穩(wěn)態(tài)。肥胖狀態(tài)下容易發(fā)生鐵代謝紊亂，機(jī)體是通過(guò)怎樣的途徑如何調(diào)節(jié)小腸鐵吸收蛋白的表達(dá)，腸鐵吸收蛋白如何調(diào)節(jié)鐵吸收，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制目前還不甚清楚。

DMT1僅在哺乳動(dòng)物小腸上皮細(xì)胞高度表達(dá)，其最主要的功能是對(duì)二價(jià)金屬離子的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，是介導(dǎo)膳食中非血紅素鐵從腸腔轉(zhuǎn)入腸細(xì)胞的唯一鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體[8]。FPN1是一種跨膜的鐵輸出蛋白，主要位于十二指腸上皮細(xì)胞的基底部和基底側(cè)膜，F(xiàn)PN1是鐵離子釋放的唯一出口，負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞。本次實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肥胖小鼠十二指腸上皮細(xì)胞的DMT1和FPN1表達(dá)水平低于正常小鼠表達(dá)水平。肥胖小鼠DMT1表達(dá)降低，說(shuō)明攝入細(xì)胞內(nèi)的鐵量減少，F(xiàn)PN1表達(dá)降低，輸出的鐵量則會(huì)減少，表明肥胖小鼠轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的能力下降，肥胖導(dǎo)致小腸上皮細(xì)胞攝取及釋放鐵的能力發(fā)生障礙。一些利用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠建立營(yíng)養(yǎng)性肥胖模型的實(shí)驗(yàn)也得到了和本研究類似的結(jié)論，肥胖可使小腸上皮細(xì)胞DMT1mRNA表達(dá)降低[9]。許多因素參與DMT1mRNA表達(dá)的調(diào)控，例如：蛋白激酶C、TNF-α、IFN-γ、炎癥介質(zhì)、不同的發(fā)育階段等。肥胖使小鼠十二指腸DMT1mRNA的表達(dá)降低，是肥胖引起上述因素調(diào)節(jié)DMT1mRNA的表達(dá)，還是肥胖狀態(tài)直接作用于DMT1mRNA的表達(dá)，還需進(jìn)一步研究。

Frazer等[10]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞基底膜FPN1表達(dá)水平僅受機(jī)體鐵狀況的影響，而不受腸腔內(nèi)鐵水平的影響；而DMT1表達(dá)水平明顯依賴腸腔內(nèi)鐵含量的調(diào)節(jié)，這提示FPN1可能是決定腸鐵吸收水平的關(guān)鍵性或限速性鐵轉(zhuǎn)運(yùn)分子。目前研究發(fā)現(xiàn)，鐵調(diào)素是一種肝臟分泌的負(fù)性鐵調(diào)節(jié)因子，其可與FPN1結(jié)合，使FPN1內(nèi)吞、降解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵貯留，減少鐵的輸出。鐵調(diào)素和FPN1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。本次Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肥胖導(dǎo)致FPN1蛋白表達(dá)下降，推測(cè)可能與肥胖機(jī)體肝臟鐵調(diào)素的表達(dá)增加有關(guān)，鐵調(diào)素表達(dá)增加造成十二指腸FPN1蛋白表達(dá)減少，腸細(xì)胞輸出的鐵量降低，進(jìn)而影響體內(nèi)鐵水平，這需要進(jìn)一步的研究，為進(jìn)一步闡明肥胖影響鐵吸收的分子機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，肥胖導(dǎo)致鐵缺乏主要與負(fù)責(zé)十二指腸腸鐵吸收的DMT1和FPN1兩種蛋白表達(dá)密切相關(guān)。肥胖可致使十二指腸DMT1和FPN1表達(dá)下降，腸上皮細(xì)胞吸收和釋放鐵的能力減弱,造成機(jī)體不能滿足對(duì)鐵的需求，導(dǎo)致肥胖鐵缺乏的發(fā)生。

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