葉華虎，袁菊芳，劉 歡，范玉筠

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071；2.北京城市學(xué)院，北京 100094)

表位(epitope)又稱抗原決定簇(antigenic determinant, AD)，是病毒、疫苗、致敏原等抗原物質(zhì)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)?，F(xiàn)代免疫學(xué)研究表明，免疫細(xì)胞在與抗原分子的相互作用過(guò)程中，細(xì)胞表面受體識(shí)別的不是整個(gè)抗原分子，而是抗原分子上的特定部位(包括線性的，或是空間結(jié)構(gòu)上相互靠近的多個(gè)氨基酸殘基)[1-2]?？梢?jiàn)，由異源蛋白活化B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體僅針對(duì)抗原上的特異性表位。隨著抗體在疾病診斷、預(yù)防、治療等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，表位鑒定已成為免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。

到目前為止，表位研究已形成了多種技術(shù)體系，如噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)、肽段掃面技術(shù)、合成肽技術(shù)、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)技術(shù)。相較于其他技術(shù)體系，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)技術(shù)具有快速、廉價(jià)等明顯優(yōu)勢(shì)[3-5]。本實(shí)驗(yàn)以在我國(guó)恒河猴體內(nèi)擴(kuò)增的B病毒囊膜蛋白gD氨基酸序列為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性、抗原性指數(shù)、柔韌性進(jìn)行分析，篩選可能的表位肽段，再結(jié)合合成肽技術(shù)，利用B病毒陽(yáng)性血清通過(guò)ELISA進(jìn)行驗(yàn)證；最后，以20份B病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清評(píng)價(jià)肽段的敏感性。本實(shí)驗(yàn)旨在為猴B病毒的防控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 gD蛋白 系從我國(guó)實(shí)驗(yàn)獼猴體內(nèi)通過(guò)PCR擴(kuò)增得到的gD基因推導(dǎo)而來(lái)，其氨基酸序列如下：該蛋白全長(zhǎng)394個(gè)氨基酸殘基，分子量約為48×103，與E2490標(biāo)準(zhǔn)毒株的同源性為97.5%。

1MGSGIAAVLL SLAVALARVP AGGGEYVPVE RSLTRVNPGR FRGAHLPPLE QKTDPPDVRR VYHVQPFVEN PFQTPSVPVAV YYAVLERAC RSVLLWAPTE AVQVVRGAPE ATRSDARYNL TVAWYRTSDD CAIPILVMEY AECQYDKPLG ACPVRNLPRW SFYDSFSATG DDDLGLLMHA PAFETAGTYV RLVKVNGWVE VTQFIFEHRG KGPCRYTLPL RILPAACLRA PVFEQGVTVD AIGMLPRFIP ENQRIVAVYS LQAAGWHGPK APFTSTLLPP EVVETANVTR PELAPEERGT SRTPGDEPAP AVAAQLPPNW HVPEASDVTI QGPAPAPSGH TGAVVGALAG AGLAAGVVVL AVYLVRRRGR AAGKHVRLPE LLEEAHGPAR RGAPY394

1.1.2 血清和抗體 B病毒陽(yáng)性血清和B病毒陰性血清，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心保存。

1.1.3 ELISA檢測(cè)試劑 氨基酶標(biāo)板購(gòu)于Nunc公司；其他ELISA試劑為湖州英創(chuàng)生物公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 脫色搖床，恒溫水浴鍋，酶標(biāo)儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 B病毒囊膜蛋白gD二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用DNAStar軟件，以Chou-Fasman方法、Karplus-Schulz方法和Gamier-Robson方法對(duì)預(yù)測(cè)gD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[6]。

1.2.2 猴B病毒囊膜蛋白gD基因B細(xì)胞表位預(yù)測(cè) 利用DNAstar軟件，用Jameson-Wolf方法對(duì)猴B病毒囊膜蛋白gD基因氨基酸序列抗原性指數(shù)區(qū)域預(yù)測(cè)[7]；用Emini方法猴B病毒囊膜蛋白gD基因氨基酸序列表面可及性區(qū)域預(yù)測(cè)[8]，用Kyte-Doolittle方法對(duì)猴B病毒囊膜蛋白gD基因氨基酸序列親水性預(yù)測(cè)[8-10]。綜合分析將上述幾種方法，兼顧各項(xiàng)預(yù)測(cè)參數(shù)對(duì)猴B病毒囊膜蛋白gD基因 B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，并以吳玉章建立的抗原性指數(shù)對(duì)預(yù)測(cè)的表位進(jìn)行綜合評(píng)判[11]。

1.2.3 肽段合成 將預(yù)測(cè)的肽段送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.4 肽段ELIS條件優(yōu)化 首先以文獻(xiàn)報(bào)道的已知表位肽(AVYLVRRRGR)為基礎(chǔ)進(jìn)行ELISA條件優(yōu)化，過(guò)程簡(jiǎn)述如下：將合成肽段用滅菌的PBS稀釋成1 mg/mL，再用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋成不同濃度，稀釋液用于包被氨基板；將包被過(guò)夜的ELISA板用PBS洗滌3次，加100 μL封閉液(博邁德生物技術(shù)公司)于37℃封閉30 min；將5份標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清混合物和3份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清混合物分別作5、10、20倍稀釋，加入酶標(biāo)板，在37℃反應(yīng)35 min；5×3 min洗滌；再加入100 μL二抗反應(yīng)液(用封閉液稀釋HRP標(biāo)記的兔抗猴IgG到30000倍)，37℃反應(yīng)35 min；5×3 min洗滌；再加入TMB顯色液100 μL，37℃反應(yīng)，8 min；最后加入50 μL的2N H2SO4終止顯色；酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm下的OD值。比較不同條件(包被量和血清稀釋倍數(shù))下的信噪比(P/N值)，確定ELISA的包被量和血清稀釋比例。

1.2.5 gD表位鑒定 將7個(gè)預(yù)測(cè)得到表位肽段按優(yōu)化確定的結(jié)果進(jìn)行稀釋和包被，并以上述血清進(jìn)行ELISA初步鑒定，ELISA結(jié)果判定：以陰性血清的OD值的2倍作為陽(yáng)性判定結(jié)果。

1.2.6 不同表位的敏感性和特異性評(píng)價(jià) 對(duì)于初步鑒定為表位的肽段，用20份B病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和10份B病毒陰性血清評(píng)價(jià)其敏感性和特異性。

2 結(jié)果

2.1 B病毒囊膜糖蛋白gD基因二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用G Gamier-Robson法和Chou-Fasman法分別對(duì)猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因的α-螺旋區(qū)域、β-折疊區(qū)域、轉(zhuǎn)角區(qū)域和柔性結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖1～圖4)。綜合分析比較兩種方法的預(yù)測(cè)結(jié)果，得出最優(yōu)效果。

2.2 猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

利用Jameson-Wolf方法對(duì)猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因抗原性指數(shù)(抗原性指數(shù)≥0)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖5)；利用Emini方法對(duì)猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因表面可及性區(qū)域(表面可及性指數(shù)≥1)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖6)；利用Kyte-Doolittle方法對(duì)猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因親水性區(qū)域(親水性指數(shù)≥0)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖7)。

篩選出具有較好抗原性指數(shù)、表面可及性和親水性且在二級(jí)結(jié)構(gòu)上含有易形成不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)和抗原表位轉(zhuǎn)角的區(qū)段，這些區(qū)段極有可能成為B細(xì)胞表位。結(jié)果顯示猴B病毒囊膜糖蛋白gD基因N端第26-34、46-54、106-116、122-130、203-214、291-306、361-370區(qū)段的抗原性指數(shù)最高，提示在這些區(qū)段是B細(xì)胞表位的可能性最大(表1)。

圖1 猴B病毒囊膜糖蛋白gD α-螺旋和β-折疊區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果

圖2 猴B病毒囊膜糖蛋白gD轉(zhuǎn)角區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果

圖3 猴B病毒囊膜糖蛋白gD無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果

圖4 猴B病毒囊膜糖蛋白gD柔性區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果

圖5 猴B病毒囊膜糖蛋白gD抗原性指數(shù)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖6 猴B病毒囊膜糖蛋白gD表面可及性預(yù)測(cè)結(jié)果

圖7 猴B病毒囊膜糖蛋白gD親水性預(yù)測(cè)結(jié)果

表1猴B病毒囊膜糖蛋白gD的表位預(yù)測(cè)結(jié)果

Tab.1Prediction of B-cell epitopes on Monkey B virus envelope protein gD

B細(xì)胞表位區(qū)域Domains of B-cell epitope氨基酸序列Amino acid sequences of epitopes26-34YVPVERSLT46-54LPPLEQKTD106-116RGAPEATRSDA122-130VAWYRTSDD203-214QFIFEHRGKGPC291-306PELAPEERGTSRTPGD361-370AVYLVRRRGR

2.3 合成肽的ELISA檢測(cè)方法建立

由于合成肽可能與重組蛋白不完全一致。實(shí)驗(yàn)先用被證實(shí)是B病毒表位肽段的AVYLVRRRGR(位于gD蛋白的361-370)為對(duì)象，分別用濃度100、150和300 ng每孔包板，并以5份標(biāo)準(zhǔn)B病毒陽(yáng)性血清的混合物和3份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行檢測(cè)(3次重復(fù))。其中血清稀釋倍數(shù)分別為1∶5、1∶10和1∶20，兔抗猴IgG-HRP的稀釋濃度為1∶30000。ELISA的OD值閾值為3份陰性血清平均OD的2倍。

結(jié)果顯示：肽段以150 ng每孔包被，血清稀釋比例為1∶5的反應(yīng)條件最好，此時(shí)信噪比最高，且結(jié)果重復(fù)性好(表2)。

2.4 gD表位鑒定

將7個(gè)肽段(表1)按照150 ng每孔包板，對(duì)5份陽(yáng)性血清的混合物和3份陰性血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，血清稀釋比例為1∶5，兔抗猴IgG-HRP工作濃度為1∶30000，OD值閾值為3份陰性樣本的平均OD值乘以2 倍。結(jié)果顯示，gD蛋白上的4個(gè)肽段(46LPPLEQKTD54、106RGAPEATRSDA116、291PELAPE ERGTSRTPGD306和361AVYLVRRRGR370)都能與B病毒陽(yáng)性血清反應(yīng)反應(yīng)，且OD值均顯示為陽(yáng)性(表3)。其余肽段均為陰性，即使將這些肽段的包被量提高到300 ng每孔，在其他ELISA參數(shù)不變的情況下，結(jié)果仍為陰性。表明這些肽段不是B病毒的表位。

表2 肽段ELISA參數(shù)的優(yōu)化

表3 ELISA方法鑒定的表位肽段

圖8 表位肽與20份陽(yáng)性血清的ELISA檢測(cè)結(jié)果(紅色表示陽(yáng)性，白色表示陰性)

2.5 不同表位的敏感性和特異性評(píng)價(jià)

將上述表位肽段按150 ng每孔包被，分別用20份B病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和10份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清鑒定各表位的敏感性和特異性。其中，血清稀釋比例為1∶5，兔抗猴IgG-HRP工作濃度為1∶30000，OD值閾值為3份陰性樣本的平均OD值乘以2 倍。結(jié)果顯示，各個(gè)肽段都不與陰性血清發(fā)生反應(yīng)，特異性為100%；但就敏感性而言，不同表位肽段各不相同，106RGAPEATRSDA116肽段的敏感性最低，僅能與20份陽(yáng)性血清的8份(40.0%)發(fā)生反應(yīng)，而361AVYLVRRRGR370)能與20份陽(yáng)性血清中的14份(70.0%)發(fā)生反應(yīng)，其他肽段的敏感性位于二者之間。

比較7個(gè)表位肽段與20份陽(yáng)性血清的反應(yīng)性發(fā)現(xiàn)，有些表位肽段的陽(yáng)性樣本完全一致，有些表位肽段的陽(yáng)性樣本只是其他表位的一部分，也有一些表位的陽(yáng)性樣本之間有交叉，但也有一些陽(yáng)性樣本在所有表位中均呈陰性表現(xiàn)(圖8)。

3 討論

對(duì)于抗原表位的研究策略，人們已建立和發(fā)展了多種方法，如噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)、但克隆抗體篩選技術(shù)、肽探針掃描技術(shù)和基于生物信息學(xué)的表位預(yù)測(cè)技術(shù)等[1-5]。其中表位預(yù)測(cè)因其簡(jiǎn)單和廉價(jià)而越來(lái)越受到研究者重視，該方法既克服了肽探針掃描需要大量肽段合成所帶來(lái)的高成本，也避免了化學(xué)和生物學(xué)方法以及噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)展示技術(shù)所要求單克隆抗體。同時(shí)該方法也是當(dāng)前廣泛采用的，并被證明是行之有效的表位研究技術(shù)[3-5]。

表位預(yù)測(cè)主要依據(jù)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性、抗原性指數(shù)以及柔韌性等參數(shù)，預(yù)測(cè)抗原的表位序列。目前開(kāi)發(fā)的分析軟件正是基于不同參數(shù)組合形成的數(shù)據(jù)庫(kù)，因而預(yù)測(cè)的結(jié)果可能有較大差異，且都存在預(yù)測(cè)失誤(包括漏測(cè)和錯(cuò)測(cè))等缺陷。有研究者統(tǒng)計(jì)，目前建立的表位預(yù)測(cè)技術(shù)，準(zhǔn)確率通常在15%～75%之間[12-13]。

我們分別利用了在線預(yù)測(cè)軟件，如ABCpred(ABCpred 采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來(lái)預(yù)測(cè)線性表位，從Bcipep 和SwissProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中提取非冗余的表位肽和非表位肽作為訓(xùn)練集，采用5- 折交叉驗(yàn)證，預(yù)測(cè)敏感性約為67%，特異性約為64%[14])、BepiPred(BepiPred 結(jié)合氨基酸的性質(zhì)，如親水性、柔韌性、可及性、極性、暴露表面、轉(zhuǎn)角和隱形馬爾可夫模型來(lái)預(yù)測(cè)線性表位，預(yù)測(cè)結(jié)果表明，同那些僅依賴于氨基酸性質(zhì)的預(yù)測(cè)方法相比，BepiPred 預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有一定程度的提高[15])、APP(基于氨基酸通常成對(duì)出現(xiàn)在抗原表位的頻率要比其出現(xiàn)在非表位肽段的頻率高并聯(lián)合支持向量機(jī)[16])等算法，同時(shí)結(jié)合國(guó)內(nèi)一些學(xué)者創(chuàng)建的軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)。綜合這些軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，在B病毒囊膜gD上得到7個(gè)可能的表位肽段。其中，預(yù)測(cè)得到的gD蛋白上的361AVYLVRRRGR370表位，已被實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，二者的差異僅為1個(gè)氨基酸殘基，即實(shí)驗(yàn)鑒定的表位為的362VYLVRRRGR370[17]。

對(duì)7個(gè)肽段的鑒定結(jié)果顯示， 4個(gè)肽段都能與B病毒的陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，表明這4個(gè)片段是B病毒的表位。對(duì)與B病毒高度同源的HSV-1囊膜蛋白gD功能研究發(fā)現(xiàn)，胞外區(qū)1-32個(gè)氨基酸殘基、Y38、D215、R222、F223是受體的結(jié)合區(qū)，負(fù)責(zé)與受體結(jié)合；胞外區(qū)280-302個(gè)氨基酸殘基為柔性折疊部位，負(fù)責(zé)維持gD構(gòu)象；胞外區(qū)C端是gB、gL/gH的結(jié)合部位，負(fù)責(zé)膜融合[18-20]。如果B病毒的gD蛋白采用與HSV-1相似的功能機(jī)制，那么在本實(shí)驗(yàn)中鑒定的3個(gè)表位(分別為46LPPLEQKTD54、106RGAPEATRSDA116和291PELAPEERGTSRTPGD306)將與功能區(qū)重合或與功能區(qū)緊密相連。這為前期文獻(xiàn)報(bào)道—以gD基因?yàn)榛A(chǔ)的核酸疫苗能較好保護(hù)免疫動(dòng)物提供了合理解釋[21-22]。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步利用20份B病毒陽(yáng)性血清對(duì)4個(gè)表位進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)表位肽與血清的反應(yīng)性不完全一致。其中，106RGAPEATRSDA116肽段的敏感性最低，僅能與20份陽(yáng)性血清的8份(40.0%)發(fā)生反應(yīng)，而已被證實(shí)的表位361AVYLVRRRGR370，敏感性為70%，與其他文獻(xiàn)報(bào)道的67%相似[22]。將多個(gè)具有互補(bǔ)作用的表位串聯(lián)，形成嵌合性多價(jià)表位蛋白/疫苗，作為檢測(cè)抗原的敏感性和/或作為疫苗的保護(hù)作用明顯增強(qiáng)，已在其他研究中得到證實(shí)[23-24]。將上述表位進(jìn)行聯(lián)合或者重組，是否有利于提高檢測(cè)的敏感性和疫苗保護(hù)效果，有待于進(jìn)一步研究。

總之，本實(shí)驗(yàn)利用生物信息學(xué)方法在B病毒囊膜蛋白gD上鑒定了4個(gè)表位，這些表位的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步開(kāi)展B病毒感染機(jī)制研究以及快速檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Gershoni JM, Roitburd-Berman A, Siman-Tov DD,etal. Epitope mapping: the first step in developing epitope-based vaccines[J]. BioDrugs. 2007;21(3):145-56.

[2] 宋帥，李春玲，賈愛(ài)卿，等. 抗原表位研究方法進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2010, 31( 12) : 87-91

[3] Zhu J, Warren JD, Danishefsky SJ. Synthetic carbohydrate-based anticancer vaccines: the Memorial Sloan-Kettering experience[J]. Expert Rev Vaccines. 2009 , 8(10):1399-413.

[4] Editorial. Immunoinformatics may lead to a reappraisal of the nature of B cell epitopes and of the feasibility of synthetic peptide vaccines[J]. J. Mol. Recognit. 2006; 19: 183-187.

[5] Das P, Grewal JS, Mahajan B,etal. Comparison of cellular and humoral responses to recombinant protein and synthetic peptides of exon2 region of Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein1 (PfEMP1) among malaria patients from an endemic region[J]. Parasitology International , 2007, 56: 51-59.

[6] Karplus P A Schultz G. Prediction of chain flexibility in proteins[J]. Natur wissenschaften,1985,72:212-213.

[7] Jameson B A Wolf H.The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinations[J]. Comput Appl Biosci,1988,4(1):181-186.

[8] Emini E A Hughes J V, Perlow D S,etal. Induction of hepatitis A virus～neutralizing antibody by a virus～specific synthetic peptide[J]. J Virol,1985,55(3):836-839.

[9] Kyte J Doolittle R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J]. J Mol Bio1,1982,157(1):105-132.

[10] Garnier J,Osguthorpe D J,Robson B.Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins[J]. Journal of molecular biology,1978,120(1):97-120.

[11] 朱錫華，吳玉章. 一種病蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)方法的建立[J]. 科學(xué)通報(bào),1994,24(2):2275-2279.

[12] Peters B, Sette A. Integrating epitope data into the emerging web of biomedical knowledge resources[J]. Nat Rev Immunol. 2007 Jun;7(6):485-90.

[13] Wee LJ, Lim SJ, Ng LF, Tong JC. Immunoinformatics: how in silico methods are re-shaping the investigation of peptide immune specificity[J]. Front Biosci (Elite Ed). 2012, 4:311-319.

[14] Saha S, Raghava GP. Prediction of continuous B-cell epitopes in an antigen using recurrent neural net work[J]. Proteins, 2006,65(1): 40-48.

[15] Larsen JE, Lund O, Nielsen M. Improved method for predicting linear B-cell epitopes[J]. Immunnome Res, 2006, 2: 2.

[16] ChenJ, LiuH, YangJ, etal. PredictionoflinearB-cellepitopes using amino acid pair antigenicity scale[J]. Amino Acids, 2007,33(3): 423-428.

[17] Perelygina L, Zurkuhlen H, Patrusheva I,etal. Identification of a herpes B virus-specific glycoprotein D immunodominant epitope recognized by natural and foreign hosts[J]. J Infect Dis, 2002, 186: 453-461.

[18] Giovine PD, Settembre EC, Bhargava AK,etal. Structure of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D Bound to the Human Receptor Nectin-1[J]. PLoS Pathogens, 2011, 7(9):489-502.

[19] Karaba AH, Kopp SJ, Longnecker R. Herpesvirus entry mediator and nectin-1 mediate herpes simplex virus 1 infection of the murine cornea[J]. J Virol. 2011 Oct;85(19):10041-10047.

[20] Atanasiu D, Saw WT, Cohen GH,etal. Cascade of events governing cell-cell fusion induced by herpes simplex virus glycoproteins gD, gH/gL, and gB[J]. J Virol. 2010 ,84(23):12292-12299.

[21] Hirano M, Nakamura S, Mitsunaga F,etal. Efficacy of a B virus gD DNA vaccine for induction of humoral and cellular immune responses in Japanese macaques[J]. Vaccine. 2002; 20(19-20):2523-32.

[22] Loomis-Huff JE, Eberle R, Lockridge KM,etal. Immunogenicity of a DNA vaccine against herpes B virus in mice and rhesus macaques[J]. Vaccine. 2001; 19(32):4865-4873.

[23] Liu S, Yu X, Wang C,etal. Quadruple antigenic epitope peptide producing immune protection against classical swine fever virus[J]. Vaccine, 2006, 24 :7175- 7180.

[24] Cairns TM, Shaner MS, ZuoY,etal. Epitope mapping of herpes simplex virus type 2 gH/gL defines distinct antigenic sites, including some associated with biological function[J]. J Virol, 2006, 80(6): 2596-2608.