易思萌，劉慧芳，曾 林，孫兆增，王 新

( 1. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109)

黑線倉(cāng)鼠白化突變系的建立是為了給人類白化病提供動(dòng)物模型，動(dòng)物白化現(xiàn)象出現(xiàn)的原因多種多樣，關(guān)于基因突變導(dǎo)致白化性狀的出現(xiàn)，已經(jīng)被很多次報(bào)道，最常見(jiàn)的是有關(guān)于酪氨酸酶的研究，但是對(duì)于倉(cāng)鼠尤其是黑線倉(cāng)鼠的白化性狀的相關(guān)研究并未出現(xiàn)明確的相關(guān)研究報(bào)道[1]?？偠灾?，基因的突變導(dǎo)致白化簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是基因控制著酶，這些酶又控制著機(jī)體生化反應(yīng)的過(guò)程，最后決定了動(dòng)物體的性狀。但是具體是哪一部分的基因出現(xiàn)突變尚有待進(jìn)一步的研究[1-2]。本文擬以肌張力異常蛋白變體X1段基因編碼區(qū)作為研究對(duì)象，依照其設(shè)計(jì)出6對(duì)引物，再通過(guò)RT-PCR的方法，試圖證明黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系肌張力異常蛋白變體X1基因編碼區(qū)之間的差異性，以及與白化現(xiàn)象是否存在聯(lián)系。肌張力異常蛋白是一種大型多域并與細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白質(zhì)，它在神經(jīng)系統(tǒng)中有著重要作用[3]。

肌張力異常蛋白主要分為三種亞型，分別為dystonin-e、dystonin-a、dystonin-b；其中的dystonin-a又可以通過(guò)可變剪接衍生出三種同種型神經(jīng)元，分別是dystonin-a1、dystonin-a2、dystonin-a3，肌張力異常蛋白變體X1是dystonin-a連接細(xì)胞骨架中重要的一段，以上三種同種型神經(jīng)元共享的N-末端肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，廣泛的卷曲螺旋區(qū)域，和一個(gè)C-末端微管結(jié)合域，從而允許用于與細(xì)胞骨架細(xì)絲相互作用并促進(jìn)它們的功能，如細(xì)胞骨架連接。雖然dystonin-a同種型具有相似的域機(jī)構(gòu)，但是區(qū)分他們并定位其亞細(xì)胞定位獨(dú)特性的N端區(qū)域；具體來(lái)說(shuō)，dystonin-a1是一個(gè)短的N端結(jié)構(gòu)域，其包括一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其位于肌動(dòng)蛋白絲，而dystonin-a2具有跨膜結(jié)構(gòu)域，它定位于核膜和核周膜；dystonin-a3擁有去豆蔻?；Y(jié)構(gòu)域，協(xié)助確定等離子體[4]。損失肌張力異常蛋白會(huì)導(dǎo)致小鼠和大鼠出現(xiàn)肌肉緊張障礙，小鼠會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)肌肉功能障礙甚至過(guò)早死，該蛋白血小板溶素保守區(qū)域決定了該蛋白的亞型特征，但其相互作用尚未有詳細(xì)的闡述和報(bào)道[3-5]。本研究旨在明確黑線倉(cāng)鼠白化突變系肌張力異常蛋白變體X1與其白化性狀產(chǎn)生機(jī)制有無(wú)影響，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)克隆肌張力異常蛋白變體X1段基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)的6對(duì)引物，分析其編碼區(qū)的序列，找出可能存在的突變位點(diǎn)，為與黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系的相關(guān)研究，提供相應(yīng)的研究數(shù)據(jù)及其理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

大腸菌株DH5a為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒RNases Mini Kit為QIAGEN公司產(chǎn)品; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T載體出自大連TaKaRa公司產(chǎn)品；標(biāo)準(zhǔn)分子量核酸DNA maker購(gòu)自Biomed；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒是QIAGEN公司的產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系，體重均在19～20 g，雌性3只，5周齡。均由軍事醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(軍)2007-004】。

1.2 方法

1.2.1 黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系皮膚組織總RNA的制備

采用活體皮膚采取的方法，采取黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系背部皮膚組織30 mg用于總RNA的制備；將30 mg左右的皮膚組織剪碎移至勻漿器內(nèi)，再按照說(shuō)明書(shū)的提取方法抽取總RNA，抽提的總RNA取2 uL測(cè)定A260/A280分析提取純度，之后再用甲醛變性電泳實(shí)驗(yàn)分析總RNA確定提取RNA的完整性。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

由同種型肌張力異常蛋白設(shè)計(jì)的6對(duì)引物擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA：

d-1-F:5’-taaacatggagacaaactga-3’；d-1-R:5’-cagcgattttctgtctcccg-3’;

d-2-F:5’-tagcctacaaaattttgaac-3’；d-2-R:5’-tatcactgaaacttccctga-3’;

d-3-F:5’-tgaggcacagtcagggaagt-3’；d-3-R:5’-gatactttggttttcatcct-3’;

d-4-F:5’-tgtaaaggaacatgaggatg-3’；d-4-R:5’-aaattggtattttctccaca-3’;

d-5-F:5’-tcttaaaagtgtggaggact-3’；d-5-R:5’-aactgcttaagctgattctt-3’;

d-6-F:5’-tctagaagctttgaagaatc-3’；d-6-R:5’-tcgtttagcttctgctcaat-3’。

1.2.3 RT-PCR

按照大連TaKaRa公司合成試劑盒提供的方法先用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第一條鏈，并且通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得大量的目的基因產(chǎn)物，之后再通過(guò)1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。25 uL的PCR擴(kuò)增體積中，組成該體系不同組分的濃度分別為：10×loading Buffer 2.5 uL，dNTP 4 uL，上游引物1 uL，下游引物1 uL，cDNA模板 2 uL，Lataq聚合酶0.25 uL，最后加無(wú)菌蒸餾水至25 uL。PCR運(yùn)行程序?yàn)?5℃欲變性5 min；95℃ 變性30 s；6對(duì)引物的退火溫度分別為d1 55℃、d2 59℃、d364℃、d4 58℃、d5 58℃、d6 61℃；72℃復(fù)性延伸2 min；35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min后終止。

1.2.4 肌張力異常蛋白cDNA的克隆及其序列測(cè)定

通過(guò)RT-PCR大量擴(kuò)增出目的基因，再經(jīng)過(guò)凝膠電泳純化分離目的基因產(chǎn)物，再用QIAGEN公司的膠回收試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物的膠回收，之后再將回收的目的基因產(chǎn)物連接到pMD-18T上，16℃連接過(guò)夜后，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)里，通過(guò)菌液PCR和1.5%瓊脂糖凝膠電泳的方法篩選鑒定陽(yáng)性重組，隨機(jī)挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆分別制備成菌液，送去Biomed測(cè)序。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用BLAST對(duì)其進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系皮膚組織總RNA的制備

用RNases Mini Kit試劑盒采取黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系皮膚的總RNA，其A260/A280的值分別為2.05、1.98、1.94、1.85；1.95、1.98、2.03、1.88.，經(jīng)瓊脂糖電泳后可見(jiàn)較清晰的八條帶，說(shuō)明所抽提的總RNA無(wú)明顯的降解，是完整的(圖1)。

注：1-4為黑線倉(cāng)鼠；5-8為黑線倉(cāng)鼠白化突變系。

2.2 RT-PCR獲取肌張力異常蛋白及其序列測(cè)定

以黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系皮膚總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄省去了純化mRNA的步驟。RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖2所示，清晰可見(jiàn)各片段的擴(kuò)增條帶產(chǎn)物，再用QIAGEN公司的膠回收試劑盒回收后，連接到質(zhì)粒pMD18-T上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)中，再經(jīng)菌液PCR鑒定成陽(yáng)性。

2.3 肌張力異常蛋白的序列比對(duì)

將RT-PCR擴(kuò)增得到的片段送去Biomed公司進(jìn)行拼接測(cè)序，獲得了6條的包含大部分編碼區(qū)的序列，編碼6條不同片段大小的氨基酸并且利用NCBI的BLAST功能比對(duì)顯示，該序列與倉(cāng)鼠的肌張力異常蛋白的基因序列具有99%的相似性，由此可知該序列與倉(cāng)鼠的肌張力異常蛋白變體X1基因序列具有高度保守性，進(jìn)一步證實(shí)了所分離基因的正確性，可以斷定該序列為黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系肌張力異常蛋白基因的編碼區(qū)序列。

利用DNASTAR軟件的MegAlign程序，將黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系的肌張力異常蛋白基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)序列共6563 bp僅存在17處突變位點(diǎn)，翻譯成氨基酸序列共24處變化，黑:白差異點(diǎn)有pos=99 R:K、pos=135Y:N、pos=140 D:N、pos=442.:Q、pos=442.:Q、pos=643K:X、pos=789R:H、pos=820 D:N、pos=851 N:D、pos=856 G:S、pos=890 C:Y、pos=1034 S:P、pos=1184 W:.、pos=1269 E:G、pos=1518 L:F、pos=1528 P:S、pos=1883 L:.、pos=1884 E:R、pos=1885 A:L、pos=1886 L:.、pos=1887 K:R、pos=1888 N:I、pos=1890 Q:S、pos=1892 K:S、pos=2024 H:R；但關(guān)鍵核酸蛋白并未見(jiàn)突變(圖3，彩插3)。

注：A:Marker 2000；1、3、5、7、9、11：為黑線倉(cāng)鼠；2、4、6、8、10：為黑線倉(cāng)鼠白化突變系。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增了黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系肌張力異常蛋白變體X1段較完整的基因編碼區(qū)，該序列通過(guò)NCBI的BLAST可知，其與黑線倉(cāng)鼠的肌張力異常蛋白變體X1段基因序列具有99%左右的相似性，通過(guò)對(duì)該序列的數(shù)據(jù)分析和生物信息學(xué)方法，鑒定了分離基因的正確性，黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系肌張力異常蛋白變體X1段基因編碼區(qū)有與倉(cāng)鼠等動(dòng)物類似的結(jié)構(gòu)序列，通過(guò)研究肌張力異常蛋白變體X1段基因序列，可以進(jìn)一步證實(shí)該類基因是否就是影響黑線倉(cāng)鼠出現(xiàn)退行性白化突變的原因，但通過(guò)對(duì)該蛋白基因片段的研究可知，我們通過(guò)RT-PCR手段擴(kuò)增得出肌張力異常蛋白變體X1段基因序列并進(jìn)行多態(tài)分析，進(jìn)而為研究肌張力異常蛋白基因與黑線倉(cāng)鼠白化性狀產(chǎn)生機(jī)制提供了相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

通過(guò)DNASTAR的MegAlign軟件，分析了黑線倉(cāng)鼠及其白化突變系肌張力異常蛋白基因編碼區(qū)的序列，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)序列存在17個(gè)突變位點(diǎn)，翻譯成氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)24處不同，分別為：pos=99 R:K、pos=135Y:N、pos=140 D:N、pos=442.:Q、pos=442.:Q、pos=643K:X、pos=789R:H、pos=820 D:N、pos=851 N:D、pos=856 G:S、pos=890 C:Y、pos=1034 S:P、pos=1184 W:.、pos=1269 E:G、pos=1518 L:F、pos=1528 P:S、pos=1883 L:.、pos=1884 E:R、pos=1885 A:L、pos=1886 L:.、pos=1887 K:R、pos=1888 N:I、pos=1890 Q:S、pos=1892 K:S、pos=2024 H:R；但是沒(méi)有關(guān)鍵蛋白出現(xiàn)變化。說(shuō)明黑線倉(cāng)鼠白化突變系白化性狀產(chǎn)生的原因與該基因?qū)е碌纳窠?jīng)退行性疾病的產(chǎn)生原因不同，并不編碼區(qū)序列的突變?cè)斐傻?，可能是與其他基因的突變有關(guān)，黑線倉(cāng)鼠白化性狀產(chǎn)生的機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。

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