劉慧芳，孫書芳，曾 林，易思萌，游 穎，馬雨楠，范君文，孫兆增，王 新

(1. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109；3. 山東省青島市中心血站，山東 青島 266071)

獼猴B病毒又稱為猴皰疹病毒Ⅰ型(cercopithecine herpesvirusⅠ)，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一可以感染人的動(dòng)物源性皰疹病毒。感染獼猴B病毒的猴終生攜帶病原，并不定期的向外排毒傳染性較強(qiáng)。當(dāng)病毒侵入人神經(jīng)系統(tǒng)，治療基本失去意義[1-4]。檢測(cè)B病毒的傳統(tǒng)方法是病毒的分離培養(yǎng)及血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。由于B病毒操作的危險(xiǎn)性、分離培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)條件要求較高，因此僅僅局限在少數(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。以B病毒作檢測(cè)抗原，由于它與人的單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-1)和人的單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)病毒具有較強(qiáng)的抗原交叉性，而難以保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性[5]。找到B病毒特異性抗原是對(duì)B病毒準(zhǔn)確診斷的關(guān)鍵所在。

一般用猴子和人血清中的IgG 來(lái)作為B病毒的診斷蛋白，在評(píng)估診斷效果時(shí)，對(duì)囊膜蛋白gB，gC，gD，gE，進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)gB囊膜蛋白的靈敏性和特異性都達(dá)到100%[6]。故本實(shí)驗(yàn)對(duì)gB囊膜蛋白基因序列進(jìn)行了合成。B病毒囊膜蛋白gB包括信號(hào)肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)4個(gè)部分。獼猴B病毒囊膜蛋白蛋白的胞外區(qū)部分比胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)有更好的免疫原性和反應(yīng)原性，是刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的有效抗原成分[7]，故本實(shí)驗(yàn)采用基因合成的方法合成胞外區(qū)部分基因序列，以便獲得重組抗原。為了新生蛋白在位于N端的信號(hào)肽的指引下到達(dá)細(xì)胞膜表面表達(dá)[8]，在gB蛋白的胞外區(qū)部分序列前加入MHC分子的Mamu-B*007:03基因序列。在合成的序列中也加入了Myc標(biāo)簽的基因序列，以便于檢測(cè)gB蛋白的胞外區(qū)表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 材料

獼猴B病毒合成基因(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)?；厥赵噭┖小⒛z回收試劑盒、DNA Marker 2000、DNA Marker 10000、2xTaqmix購(gòu)自北京博邁德生物公司。T4連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ等，購(gòu)自 NEB公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自 Invitrogen 公司。細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自 Hyclone 公司。Myc標(biāo)簽一抗購(gòu)自AB-mart公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，購(gòu)自中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 gB基因合成

從GenBank 上獲得 B 病毒的gB 蛋白胞外區(qū)序列，在序列前加入MHC分子的一段序列，使gB蛋白序列在細(xì)胞膜表面表達(dá)，然后加入信號(hào)肽序列引導(dǎo)該序列的表達(dá)。在序列兩端加入BamHⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。合成序列總長(zhǎng)度為1762 bp,命名為gB合。然后根據(jù)gB合基因的堿基序列，設(shè)計(jì)獼猴gB合基因的鑒定引物，上游引物5’- ggcccctcgttccgcttctcctc-3’，下游引物5’- cagcttgcgggcctcgttccacag-3’，擴(kuò)增片段為494 bp，以上均由北京博邁德生物有限公司合成。由于綠色熒光蛋白可能會(huì)對(duì)新構(gòu)建的融合蛋白有影響，因此首先利用基因工程的方法將載體中的綠色熒光蛋白基因去掉。

1.2.2 pEGFP-N3-gB合重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將合成的gB基因提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，對(duì)于pEGFP-N3質(zhì)粒進(jìn)行相同的酶切，然后用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用PCR的方法選出陽(yáng)性克隆，對(duì)于PCR陽(yáng)性的質(zhì)粒，利用酶切的方法進(jìn)一步鑒定。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

用含有10%胎牛血清的DMEM于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)293細(xì)胞，傳代于6孔板。當(dāng)6孔板的密度在對(duì)數(shù)期且密度在70%，用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，收集細(xì)胞做以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Western blot 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)普利萊基因公司的細(xì)胞核-胞漿-胞膜制備試劑盒提取蛋白。取50 μL總蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進(jìn)行Western-blot檢測(cè)。對(duì)PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Myc一抗4℃搖床孵育12 h，清洗后加入山羊抗鼠的二抗，室溫孵育2 h，用TBST緩沖液清洗3次后加入發(fā)光劑顯色于暗室進(jìn)行X-光片曝光、顯影。

1.2.5 細(xì)胞表達(dá)定位實(shí)驗(yàn)

連續(xù)培養(yǎng)24 h后，利用4%多聚甲醛固定15 min對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，0.3%Triton X-100透化處理。加入10%的BSA封閉后再孵育myc標(biāo)簽一抗，F(xiàn)ITC(fluorescein isothiocyanate isomer I, 異硫氰酸熒光素)熒光二抗。接著用濃度為1 ug/mL的Rase(1 mL/孔)消化RNA然后加入PI，600 uL染色10 min。然后加入抗熒光猝滅封固液，固定封片，最后利用共聚焦顯微鏡，觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 基因合成結(jié)果分析

利用BamHⅠ和NotⅠ對(duì)gB合基因進(jìn)行酶切鑒定，得到目的片段(圖1)。基因片段大小在1000 bp～2000 bp之間，與預(yù)期結(jié)果1762 bp基本相符。

注：M：2000 DNA marker; 1:重組質(zhì)粒PMD18-T-gB合的BamHⅠ和NotⅠ雙酶切結(jié)果。

2.2 pEGFP-N3-gB合重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果分析

將gB合從基因合成的質(zhì)粒上切下，利用T4連接酶將片段定向連接到pEGFP-N3載體。將連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用PCR的方法選出陽(yáng)性克隆，對(duì)于PCR陽(yáng)性的質(zhì)粒，利用酶切的方法進(jìn)一步鑒定(圖2)。

注：A(PCR) M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-GB合的PCR鑒定結(jié)果；B(酶切)M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2 重組質(zhì)粒pEGFP-N3-GB合的BamHⅠ和NotⅠ雙酶切結(jié)果。

2.3 pEGFP-N3-gB合的Western-Blot鑒定

利用Western-Blot對(duì)pEGFP-N3-gB合的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。蛋白分子量大小預(yù)測(cè)為65.2×103，Western-Blot結(jié)果顯示目的蛋白分子量大小接近70×103(圖3)，與預(yù)期結(jié)果65.2×103基本相符。

注：1.質(zhì)粒pEGFP-N3對(duì)照；2.重組質(zhì)粒pEGFP-N3-gB合的蛋白表達(dá)，M，低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 pEGFP-N3-gB合在細(xì)胞內(nèi)的定位表達(dá)

對(duì)含有Myc標(biāo)簽的pEGFP-N3-gB合重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)myc標(biāo)記的蛋白發(fā)出明亮的綠色熒光，細(xì)胞核為紅色球形(圖4，彩插2)。進(jìn)一步觀察重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，重組蛋白在細(xì)胞膜上表達(dá)，這與預(yù)期加入MHC分子引導(dǎo)序列在細(xì)胞膜上的表達(dá)相一致。

3 討論

隨著對(duì)獼猴B病毒結(jié)構(gòu)的研究不斷深入，特別是獼猴B病毒的全基因組測(cè)序的完成，囊膜糖蛋白(glycoprotein)逐漸成為獼猴B病毒診斷和防治研究的主要靶點(diǎn)。國(guó)內(nèi)已利用基因工程技術(shù)產(chǎn)生獼猴B病毒囊膜重組蛋白，隋麗華等[9]，利用原核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生gB蛋白特異性表位重組抗原，嚴(yán)翔等[10]用桿狀病毒作為表達(dá)載體構(gòu)建了gB合成基因的桿狀病毒質(zhì)粒。段博芳等[11]用獼猴B病毒gB基因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，以上證實(shí)重組蛋白具有較好的抗原性。

為了進(jìn)一步觀察gB重組蛋白的在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)合成gB胞外區(qū)基因，構(gòu)建了pEGFP-N3-GB合重組質(zhì)粒，在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)并觀察在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。結(jié)果顯示，pEGFP-N3-GB合重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，利用亞細(xì)胞定位技術(shù)證明了gB蛋白的胞外區(qū)基因序列能在細(xì)胞膜表面高效表達(dá)重組蛋白，為獲得獼猴B病毒靈敏性和特異性較好的重組蛋白提供好的方法，為下一步檢測(cè)試劑盒的制備奠定的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 肖鏡，付瑞，賀爭(zhēng)鳴，等. 猴B病毒gD-多肽ELISA 檢測(cè)方法的建立[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2008，25(2)： 20-23

[2] Weigler B J. Biology of virus in macaque and human hosts a review [J]. Clin Iect D is, 1992，14: 555-567.

[3] Xuan X, Kojima A, Murata T,etal. Analysis of canine herpes virus gB, gC and gD expressed by a recombinant vaccine virus[J]. Arch Virol, 1997, 142: 1003-1010.

[4] Besecher M I, Harden H E, Li G,etal. Discovery of herpes Bvirus-encoded micro RNAs[J]. Virology, 2009, 83(7): 3413-3416.

[5] 盤寶進(jìn). 用 B病毒 ELISA 和人單純皰疹病毒Ⅰ型酶免疫法檢測(cè)食蟹猴血清中 B 病毒相關(guān)抗體的研究[J]. 廣西畜牧獸醫(yī), 2005, 21(1): 10-12.

[6] Perelygina L, Patrusheva I, Hombaiah S,etal. Production of herpes B virus recombinant glycoproteins and evaluation of their diagnostic potential[J]. Journal of clinical microbiology, 2005, 43(2): 620-628.

[7] 張小飛，葉華虎，趙彥斌，等. 猴 B病毒囊膜蛋白gB特異性抗原表位的篩選與表達(dá)鑒定[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志， 2010 (10): 10-14.

[8] 彭佳師，龔繼明. 信號(hào)肽與蛋白質(zhì)的分選轉(zhuǎn)運(yùn)[J]. 植物生理學(xué)報(bào),2011，47(1)：9-17.

[9] 隋麗華，劉一，趙彥斌，等. 獼猴 B病毒gB蛋白特異性抗原表位的合成和表達(dá)[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2013 (3)：4-7.

[10] 嚴(yán)翔, 曹玉華, 劉慧芳, 等. 獼猴 B病毒gB和gC合成基因重組桿狀病毒質(zhì)粒的構(gòu)建[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2013， 30(6).

[11] 段博芳，王瓊，鍛綱，等. 猴B病毒gB基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2012，28(7)：674-678.