王雯婕， 陳 劍， 劉小勇， 曲藝欣， 周 清， 袁晟辰， 郝曉寧

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，廣東廣州 510632)

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferativevitreoretinopathy，PVR)是視網(wǎng)膜脫離的嚴(yán)重并發(fā)癥也是視網(wǎng)膜脫離復(fù)位手術(shù)失敗的常見原因[1]。PVR是指移行到脫離的視網(wǎng)膜表面和下方及脫離的玻璃體后表面的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinalpigmentepithelium，RPE)和膠質(zhì)細(xì)胞增殖形成膜，膜的收縮導(dǎo)致視網(wǎng)膜皺縮、固定及脫離的一種病變。PVR是常見的難治性致盲性眼病之一，約5%～10%的孔源性視網(wǎng)膜脫離發(fā)生PVR[2-3]。

目前，臨床上治療PVR的基本方法是玻璃體切割手術(shù)，盡管手術(shù)設(shè)備和技術(shù)都有很大提高，但是術(shù)后PVR復(fù)發(fā)仍很常見[4]。由于PVR是由細(xì)胞增生和收縮引起的病變，因此藥物治療抑制增殖膜的形成是治療的關(guān)鍵，主要有抗代謝藥、皮質(zhì)類固醇、維生素及其衍生物等[5]，而天然植物源性藥物的研究目前也受到重視[6]。

白藜蘆醇(resveratrol,Res)是天然多酚類化合物，主要來源于葡萄、虎杖等植物。Res是一種生物性很強(qiáng)的天然抗氧化劑，有抗氧化、抗炎、降低血小板聚集、抗增殖和抗腫瘤等作用[7-8]。本文以視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株ARPE-19為研究對(duì)象，探討Res對(duì)ARPE-19細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制，為其用于PVR的治療和術(shù)后預(yù)防復(fù)發(fā)提供資料。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞、試劑和儀器

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株ARPE-19由中山眼科中心惠贈(zèng)。

Res、胰蛋白酶干粉和EDTA(Sigma)；CCK-8試劑盒(Dojindo)；DMEM/F12和胎牛血清(FBS)(HyClone)；小鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)(Proteintech)；RNA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)。倒置顯微鏡(Leica)；酶標(biāo)儀(Safire)；FACSAria流式細(xì)胞儀(BD)；激光共聚焦顯微鏡510(Zeiss)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 將ARPE-19細(xì)胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，并于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至基本匯滿培養(yǎng)瓶底時(shí)，用0.25%胰酶和0.02% EDTA消化，按1∶2～1∶3傳代培養(yǎng)。

2.2CCK-8檢測(cè)Res對(duì)ARPE-19細(xì)胞增殖的影響 將ARPE-19以1×104cells/well接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，用含0、50、100、150、200和300μmol/LRes的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24 、48 和72h，0μmol/LRes處理組為對(duì)照組，吸去上清，各孔加入含10%CCK-8的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育2.5h后酶標(biāo)儀測(cè)450nm處吸光度(A)值。細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferationindex)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%，空白組為不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。每組5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Res對(duì)ARPE-19細(xì)胞周期分布和凋亡的影響 將ARPE-19細(xì)胞以2×105cells/well接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后用0、100、150及200 μmol/L Res分別處理細(xì)胞48 h，0 μmol/L Res處理組為對(duì)照組。胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，加入70%冰乙醇固定過夜，離心后棄上清，PBS洗滌兩遍，加入200 μL碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色，37 ℃避光孵育15 min，過濾后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期各期分布。收集各組細(xì)胞懸液，離心棄上清，200 μL binding buffer重懸，5 μL Annexin V-FITC染色孵育10 min，離心棄上清，200 μL binding buffer重懸，10 μL PI染色，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

2.4免疫熒光檢測(cè)Res對(duì)ARPE-19表達(dá)PCNA的影響 生長(zhǎng)狀況較好的ARPE-19消化制備細(xì)胞懸液，接種2滴細(xì)胞懸液于裝有蓋玻片的6孔板中，2h后待細(xì)胞貼壁后每孔加入含0μmol/L、150μmol/LRes的培養(yǎng)基2mL，培養(yǎng)48h，PBS沖洗后多聚甲醛室溫固定20min，3g/L的TritonX-100破膜30min，5%驢血清封閉1h，加入PCNAⅠ抗4 ℃孵育過夜，洗去孵育液，加入Cy3熒光Ⅱ抗，室溫孵育40min，洗去孵育液，加DAPI核染，室溫孵育30min，洗去孵育液，滴抗熒光淬滅劑封片，4 ℃冰箱避光保存，共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

2.5Real-time PCR檢測(cè)PCNA、P21和P27 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞分組同流式檢測(cè)，按Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA 2 μL，dddH2O 6.8 μL。引物序列設(shè)計(jì)如下：PCNA的上游引物為5’-AGACTTTCCTCCTTCCCGCCTG-3’，下游引物為5’-AGGTCCTTGAGTGCCTCCAACA-3’；P21的上游引物為5’-TCCAGCGACCTTCCTCATCCA-3’，下游引物為5’-TCCATAGCCTCTACTGCCACCA-3’；P27的上游引物為5’-GGACGATCCTCCTCCAAGACAA-3’，下游引物為5’-CTGGGCATTCAGAGCGGGATTA-3’；β-actin的上游引物為5’-AGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’，下游引物為5’-AAGGGTGTAACGCAGCAAAG-3’。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。結(jié)果用相對(duì)定量分析方法2-ΔΔCt分析。以β-actin為內(nèi)參照計(jì)算PCNA、P21和P27的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件作統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 倒置顯微鏡觀察ARPE-19細(xì)胞生物學(xué)特性

傳代后ARPE-19細(xì)胞24 h內(nèi)已貼壁, 細(xì)胞逐漸由圓形伸展呈多形性,多呈紡錘形、短梭形及三角形等, 可見黑色素顆粒圍繞透明的細(xì)胞核周圍, 呈集落生長(zhǎng)；4～5 d細(xì)胞生長(zhǎng)開始融合，見圖1。

Figure 1. The morphology of ARPE-19 cells observed under inverted microscope (×50). A: 24 h after passage; B: 96 h after passage.

2 Res對(duì)ARPE-19細(xì)胞增殖的影響

Res對(duì)RPE增殖有一定的抑制作用，且隨著濃度和作用時(shí)間增加，其抑制作用增強(qiáng)，見表1。雖處理24 h時(shí)Res各濃度組與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)，但50～200 μmol/L組增殖率都大于60%，不能有效抑制細(xì)胞增殖；處理48 和72 h能有效抑制細(xì)胞增殖，各濃度組與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，因此為使細(xì)胞達(dá)到半數(shù)抑制且不增加作用時(shí)間，處理48 h是最佳抑制時(shí)間，150 μmol/L是最佳濃度，見圖2。

表1不同濃度Res作用ARPE-19細(xì)胞24h、48h、72h后CCK-8結(jié)果

Table 1. TheA450 values of ARPE-19 cells treated with resveratrol at different doses for 24 h, 48 h and 72 h (Mean±SD.n=15)

Group24 h48 h72 hControl0.4528±0.03020.4882±0.01940.5017±0.0165Res 50 μmol/L0.3683±0.0307?0.3527±0.0202?0.3504±0.0220?Res 100 μmol/L0.3235±0.0251?0.2996±0.0187??0.2936±0.0261??Res 150 μmol/L0.3113±0.0238?0.2571±0.0207??0.2446±0.0245??Res 200 μmol/L0.2806±0.0267?0.2329±0.0212??0.1994±0.0204??Res 300 μmol/L0.2185±0.0275??0.1109±0.0186??0.0388±0.0252??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

3 Res對(duì)ARPE-19細(xì)胞周期的影響

100、150和200 μmol/L 的Res處理ARPE-19細(xì)胞48 h后，S期細(xì)胞所占百分比分別為(38.80±0.28)%、(41.28±0.07)%和(49.57±0.41)%，與對(duì)照組[(11.33±0.03)% ]相比，比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Res對(duì)ARPE-19細(xì)胞的S期阻滯作用具有濃度-效應(yīng)關(guān)系，隨作用濃度的增加S期所占比例逐漸增加。

4 Res對(duì)ARPE-19細(xì)胞凋亡的影響

Res作用于ARPE-19細(xì)胞48 h后，Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，正常細(xì)胞在流式細(xì)胞分析圖的B3區(qū)；早期凋亡在流式細(xì)胞分析圖的B4區(qū)；晚期凋亡在流式細(xì)胞分析圖的B2區(qū)；流式細(xì)胞分析圖的B1區(qū)為機(jī)械損傷細(xì)胞。白藜蘆醇對(duì)ARPE-19細(xì)胞沒有毒性作用，方差分析顯示，100、150 和200 μmol/L Res處理ARPE-19細(xì)胞48 h后的凋亡率與對(duì)照組沒有差異(P>0.05)，見圖4。

Figure 2. The inhibitory effects of resveratrol on ARPE-19 cell proliferation. Mean±SD. n=15. * P<0.05, ** P<0.01 vs 0 μmol/L.

Figure 3. The effects of resveratrol on the cell cycle of ARPE-19 cells. n=9.

Figure 4. The effects of resveratrol on apoptosis of ARPE-19 cells.

5 免疫熒光檢測(cè)Res對(duì)ARPE-19細(xì)胞表達(dá)PCNA蛋白的影響

共聚焦顯微鏡下觀察，與對(duì)照組相比，150 μmol/L Res作用ARPE-19細(xì)胞48 h，胞核熒光明顯減弱，PCNA蛋白表達(dá)減少，見圖5。 這說明Res對(duì)ARPE-19細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)有抑制作用。

6 Real-time PCR檢測(cè)Res對(duì)ARPE-19細(xì)胞PCNA、P21和P27 mPNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，100、150和200 μmol/L Res組PCNA mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，且隨作用濃度的增加PCNA mRNA的表達(dá)逐漸減少；而P21和P27的mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，且隨作用濃度的增加，P21和P27 的mRNA表達(dá)逐漸增多，見圖6。

討 論

Res是一種生物性很強(qiáng)的天然多酚類物質(zhì)，有抗氧化、抗腫瘤、抗血小板、抗增殖等多種生物學(xué)功能，可以預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化[9]、心腦血管疾病[10]、癌癥[11]、年齡相關(guān)性黃斑病變[12]等多種疾病。關(guān)于Res抗增殖功能，抑制腫瘤細(xì)胞增殖及調(diào)節(jié)凋亡的作用和機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)，而Res對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖影響的報(bào)道卻較少。

本實(shí)驗(yàn)用不同濃度Res作用ARPE-19細(xì)胞24、48和72 h后，通過CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Res對(duì)ARPE-19細(xì)胞的增殖有抑制作用，且在同一作用時(shí)間下，不同濃度的Res對(duì)ARPE-19細(xì)胞增殖的抑制程度不同，相同作用時(shí)間下，抑制率隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的濃度-效應(yīng)依賴關(guān)系，同一濃度的Res對(duì)ARPE-19細(xì)胞增殖的抑制程度隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系，150 μmol/L Res作用48 h，能使ARPE-19細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到50%以上，與其它研究結(jié)果相同[13]。細(xì)胞增殖是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，其依賴于細(xì)胞周期的正常運(yùn)行且涉及多個(gè)基因正常的有序表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)觀察到Res作用48 h可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞周期阻滯在S期，且隨藥物濃度增加S期阻滯越明顯。此外，Res各濃度組與對(duì)照組比較，對(duì)ARPE-19細(xì)胞凋亡率的影響無顯著差異，表明Res對(duì)ARPE-19細(xì)胞沒有毒性，與之前的報(bào)道一致[14]。

Figure 5. The effect of resveratrol on the protein expression of PCNA in ARPE-19 cells tested by immunofluorescence (×200).

Figure 6. The effects of resveratrol on the mRNA expression of PCNA, P21 and P27 tested by real-time PCR. Mean±SD. n=3. * P<0.05, ** P<0.01 vs 0 μmol/L.

PCNA是一種核內(nèi)蛋白，是真核生物DNA聚合酶的亞單位、δ聚合酶的激活因子，通過與不同復(fù)制相關(guān)蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)DNA復(fù)制過程，同時(shí)PCNA還通過不同調(diào)控方式與多種細(xì)胞因子作用，參與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡等許多重要細(xì)胞事件，另外PCNA作為細(xì)胞增殖的指標(biāo)，參與腫瘤等細(xì)胞增殖性疾病的發(fā)生發(fā)展[15-16]。通過免疫熒光方法對(duì)PCNA表達(dá)的檢測(cè)，根據(jù)PCNA的表達(dá)強(qiáng)弱明確DNA復(fù)制多少來確定細(xì)胞增殖的促進(jìn)或抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Res作用組ARPE-19細(xì)胞中PCNA表達(dá)下降，表明ARPE-19增殖減慢，生長(zhǎng)受到抑制，與CCK-8、流式結(jié)果一致。

p21基因，全稱p21WAF1/CIP1，定位于6號(hào)染色體p21.2，是p53基因的下游基因，其編碼的蛋白P21是目前所知最廣泛的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子，可與周期蛋白(cyclin)、周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)結(jié)合，使多數(shù)的cyclin-CDK復(fù)合物的激酶活性受到抑制，調(diào)控細(xì)胞周期使細(xì)胞停滯[17]。此外，P21WAF1/CIP1的羧基末端可與PCNA結(jié)合，阻止DNA全酶在DNA單鏈的滑動(dòng)，從而抑制DNA的復(fù)制，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，且P21蛋白可通過P53蛋白的調(diào)節(jié)間接參與DNA損傷修復(fù)過程[18]。p27基因定位于12號(hào)染色體，其編碼的蛋白質(zhì)P27類似于P21，是一種廣譜CDK抑制劑，抑制cyclin D1-CDK4和cyclin E-CDK2復(fù)合物活性，對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Res作用ARPE-19細(xì)胞48 h，ARPE-19細(xì)胞PCNA mRNA表達(dá)下降，而P21和P27 mRNA表達(dá)增加，呈一定的濃度依賴效應(yīng)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)100～200 μmol/L的Res作用48 h可顯著抑制ARPE-19細(xì)胞增殖，使細(xì)胞阻滯在S期，且沒有細(xì)胞毒性，其作用機(jī)制可能與上調(diào)P21和P27表達(dá)及下調(diào)PCNA表達(dá)有關(guān)。因此，Res有望成為新型抗增殖藥物，且其天然來源廣泛。但是，Res對(duì)活體眼的藥效和有無毒性反應(yīng)仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期為臨床治療和預(yù)防增生性玻璃體視網(wǎng)膜疾病尋找新方法。

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