劉 玲， 王建剛， 李 艷， 王淑英

(河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，河南 洛陽(yáng) 471003)

多藥耐藥性(multidrug resistance, MDR)是腫瘤化療失敗的重要原因，P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的高表達(dá)是腫瘤MDR的重要機(jī)制之一。P-gp為mdr1a基因的產(chǎn)物，由1 280個(gè)氨基酸組成，分子量170～180 kD，屬于能量依賴性藥物外排泵，可將抗癌藥物由腫瘤細(xì)胞內(nèi)外排至細(xì)胞外，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥量減少，引起MDR的產(chǎn)生[1]。P-gp逆轉(zhuǎn)劑都是P-gp底物，可競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性抑制P-gp的外排功能，從而增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積，達(dá)到逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的目的。PSC833是環(huán)孢菌素D的衍生物，具有非常強(qiáng)的P-gp逆轉(zhuǎn)作用，同時(shí)沒(méi)有環(huán)孢菌素A(cyclosporine A， CsA)的免疫抑制作用，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種較好的P-gp抑制劑，也是目前唯一的進(jìn)行臨床研究的P-gp逆轉(zhuǎn)劑。體外試驗(yàn)研究表明，PSC833對(duì)P-gp的抑制作用是CsA的10～20倍，對(duì)P-gp的結(jié)合力也比CsA高，因而不易被P-gp泵出到細(xì)胞外[2]。本實(shí)驗(yàn)擬觀察環(huán)孢菌素D衍生物PSC833能否逆轉(zhuǎn)人白血病細(xì)胞耐藥株K562/DOX的抗凋亡作用，以及與凋亡調(diào)控蛋白表達(dá)的關(guān)系，深入探討其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料與細(xì)胞培養(yǎng)

PSC833由中國(guó)藥科大學(xué)何玲教授提供；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco)；MTT (Sigma)；Annexin V/PI雙染試劑盒(BD)；鹽酸阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)、硫酸長(zhǎng)春新堿(上海華聯(lián)制藥有限公司)；活性氧(DCFH-DA)檢測(cè)試劑盒和線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)、Fluo-3/AM、細(xì)胞裂解液、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒、線粒體分離試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；細(xì)胞周期測(cè)定試劑盒、ECL檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞色素 C(cytochrome C, Cyt C)、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、β-actin抗體和anti-rabbit IgG購(gòu)于Bioworld。其余試劑均為市售分析純。

人白血病細(xì)胞系K562及其耐藥細(xì)胞系K562/DOX(耐阿霉素)、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)由本室保存和提供。K562/DOX、K562和HUVECs用含10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)，在K562/DOX細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0.5 μmol/L阿霉素，實(shí)驗(yàn)前14 d更換無(wú)阿霉素的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。

2 方法

2.1MTT法測(cè)定PSC833的耐藥逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562/DOX和K562細(xì)胞，以5×104cells/well的密度接種于96孔板，24 h后加入不同濃度的DOX/VCR，檢測(cè)在有或無(wú)PSC833存在條件下，DOX/VCR對(duì)細(xì)胞的毒性。PSC833終濃度為1、 2.5、 5和10 μmol/L?？瞻讓?duì)照組加入等體積的PBS。每一濃度設(shè)4個(gè)平行孔。待細(xì)胞與藥物作用44 h后，每孔加入5 g/L MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入細(xì)胞裂解液，靜置過(guò)夜使細(xì)胞裂解結(jié)晶全部溶出，用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定吸光度(A)，按以下公式計(jì)算抑制率，并求出半數(shù)抑制率(IC50)和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(reversal fold, RF)。抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A/空白對(duì)照組A)×100%；RF= IC50(單用細(xì)胞毒藥物)/ IC50(細(xì)胞毒藥物+P-gp逆轉(zhuǎn)劑)。

同時(shí)，采用MTT法檢測(cè)PSC833對(duì)HUVECs的毒性作用，方法同上。

2.2PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化接種到培養(yǎng)瓶中，次日，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)組別設(shè)置加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組、PSC833單用組(10 μmol/L)、DOX單用組(10 μmol/L)、DOX(10 μmol/L)和PSC833(2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)合用組；藥物作用24 h后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集細(xì)胞；用PBS洗滌細(xì)胞2次(2 000 r/min 離心5 min)，收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L；制備的單細(xì)胞懸液用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇固定2 h，4 ℃保存，染色前用PBS洗去固定液；加100 μL RNase A 37 ℃水浴30 min；再加入400 μL PI染色混勻，4 ℃避光30 min；上機(jī)檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm 處紅色熒光。

2.3AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562/DOX細(xì)胞接種于6孔板中，分組同上，經(jīng)PSC833 2.5、5和10μmol/L作用24h后，將收集的細(xì)胞用冷PBS洗2次，緩沖液(bindingbuffer)用三蒸水稀釋10倍，用緩沖液配成1×109/L的細(xì)胞濃度；吸取100μL至試管中，加入AnnexinV試劑和PI各5μL，混勻避光孵育15min；加入400μL染色緩沖液，混勻，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位、活性氧水平和細(xì)胞內(nèi)鈣 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞，消化后接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，分組同上。換用含3%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加入藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，離心，棄上清，重懸于0.5 mL含3%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。加入0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。孵育結(jié)束后，600×g4 ℃離心3～4 min，棄上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次后，用適量JC-1染色緩沖液重懸后，用流式細(xì)胞術(shù)分析。

藥物作用24 h后，細(xì)胞處理同上。按照1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。

藥物作用24 h后，細(xì)胞處理同上。換用含3%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加入藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，離心，棄上清。加入5 μmol/L Fluo-3/AM，37 ℃孵育30 min，再次洗滌后，用流式細(xì)胞術(shù)分析。

2.5Westernblotting檢測(cè)蛋白表達(dá) 加藥處理細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞并用裂解液裂解細(xì)胞獲得總蛋白。采用BCA試劑盒于562nm處測(cè)定樣品蛋白含量。然后，采用12%SDS-PAGE分離總蛋白，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h。封閉過(guò)的膜用TBST洗滌3次。將膜放入雜交袋中，加入Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜，使抗原抗體充分結(jié)合。隔天，將膜從雜交袋中取出，用TBST洗滌3次；再放入新雜交袋中，加入Ⅱ抗以結(jié)合Ⅰ抗，室溫孵育膜2h?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參照β-actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0軟件分析，組間均數(shù)的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PSC833對(duì)K562/DOX細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

K562/DOX細(xì)胞對(duì)DOX和VCR的耐藥倍數(shù)分別為52.44和564倍；PSC833與DOX/VCR合用后，IC50呈劑量依賴性減少，而RF呈劑量依賴性增加；對(duì)K562細(xì)胞，則不改變其IC50值，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1、2。

表1 PSC833對(duì)K562/DOX細(xì)胞DOX的耐藥逆轉(zhuǎn)作用

*P<0.05,**P<0.01vsDOX.

表2 PSC833對(duì)K562和K562/DOX細(xì)胞VCR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用

**P<0.01vsVCR.

PSC833在50 μmol/L以下時(shí)對(duì)HUVECs細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，細(xì)胞存活率在90%以上，見(jiàn)圖1。

2 PSC833對(duì)DOX阻滯細(xì)胞周期的影響

與對(duì)照組相比，PSC833單用組和DOX單用組對(duì)細(xì)胞周期影響較小。而PSC833合用DOX可劑量依賴性增加G2/M期細(xì)胞的比例，減少G0/G1期細(xì)胞的比例，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，對(duì)S期細(xì)胞的比例無(wú)明顯改變，表明PSC833的耐藥逆轉(zhuǎn)作用與阻滯細(xì)胞周期G2/M期有關(guān)，見(jiàn)圖2。

Figure 1. The effect of PSC833 on HUVEC growth.Mean±SD.n=3.

Figure 2. The effect of PSC833 on DOX-induced cell cycle progression in K562/DOX cells.

3 PSC833對(duì)DOX誘導(dǎo)線粒體膜電位的影響

與對(duì)照組相比，PSC833單用組和DOX單用組對(duì)線粒體膜電位影響較小。與DOX單用相比，PSC833和DOX合用后引起線粒體膜電位下降，Q4區(qū)比率明顯增加，表明線粒體膜電位降低幅度加大，達(dá)到85.9%,見(jiàn)圖3。

4 PSC833對(duì)DOX引起的活性氧水平的影響

與對(duì)照組相比，PSC833單用組和DOX單用組對(duì)活性氧水平影響較小。與DOX單用組相比，PSC833和DOX合用后可引起活性氧水平顯著增加，見(jiàn)圖4。

5 PSC833對(duì)DOX引起的細(xì)胞內(nèi)鈣的影響

PSC833和DOX合用后，K562/DOX細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯升高，[Ca2+]i增加；單用PSC833和單用DOX細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i均未見(jiàn)顯著變化，見(jiàn)圖5。

6 PSC833對(duì)DOX誘導(dǎo)的K562/DOX細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，PSC833單用時(shí)對(duì)K562/DOX細(xì)胞凋亡率影響較小，DOX單用時(shí)對(duì)K562/DOX細(xì)胞凋亡率僅8.25%。隨著PSC833濃度的增加，早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)量顯著增加，且作用呈劑量依賴性，見(jiàn)圖6。

7 PSC833對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的K562/DOX細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

與對(duì)照組相比，PSC833和DOX單用時(shí)對(duì)凋亡蛋白Cyt C、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3表達(dá)影響較?。籔SC833和DOX作用24 h后，線粒體中的Cyt C表達(dá)減少，而胞漿中Cyt C的表達(dá)水平相應(yīng)增加；Bcl-2下調(diào)，Bax上調(diào)，caspase-3前體剪切形成活化的cleaved caspase-3，并且cleaved caspase-3的表達(dá)量隨著PSC833的濃度增加而升高，誘導(dǎo)K562/DOX耐藥細(xì)胞凋亡,見(jiàn)圖7。

Figure 3. The effect of PSC833 on DOX-induced mitochondrial membrane potential in K562/DOX cells.Mean±SD.n=3.** P<0.01 vs DOX.

Figure 4. The effect of PSC833 on DOX-induced intracellular ROS production in K562/DOX cells. Mean±SD.n=3.** P<0.01 vs DOX.

Figure 5. The effect of PSC833 on DOX-induced intracellular calcium fluorescent intensity in K562/DOX cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05, ** P<0.01 vs DOX.

討 論

關(guān)于MDR產(chǎn)生的機(jī)理目前還不特別明確，但大多數(shù)具M(jìn)DR的細(xì)胞膜表面都有P-gp的過(guò)度表達(dá)。K562/DOX耐藥細(xì)胞系是由K562細(xì)胞經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的阿霉素誘導(dǎo)和篩選而建立起來(lái)的典型的耐藥細(xì)胞系，mdr1 mRNA及P-gp高表達(dá)，不僅對(duì)誘導(dǎo)藥物阿霉素有很強(qiáng)的耐藥性，而且對(duì)抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥性。PSC833作為多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑，能增強(qiáng)MDR細(xì)胞系對(duì)其它化療藥物如阿霉素、紫杉醇等的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，PSC833可增加耐阿霉素的肺癌細(xì)胞株(SK-MES-1/DX1000)對(duì)阿霉素的敏感性，降低P-gp底物Rh123在細(xì)胞內(nèi)的累積，下調(diào)MDR1 mRNA和P-gp的表達(dá)，激活JNK/c-Jun/AP-1通路和抑制NF-κB的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株(SK-MES-1/DX1000)對(duì)阿霉素的耐藥性[3]。

腫瘤的多藥耐藥性與抗凋亡作用關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素可激活細(xì)胞內(nèi)酸性鞘磷脂酶，導(dǎo)致神經(jīng)酰胺形成，最終激活caspase-3而引起細(xì)胞凋亡，caspases的活化及其所引發(fā)的細(xì)胞毒作用也需要酸性的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境[4]。作為抗凋亡分子，P-gp可跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性鞘磷脂，通過(guò)減少質(zhì)膜上的鞘磷脂使神經(jīng)酰胺生成減少，阻止凋亡的發(fā)生；P-gp還可通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)pH, 降低細(xì)胞內(nèi)游離藥物濃度，并使caspases處于失活狀態(tài)，從而抑制caspases依賴性的細(xì)胞凋亡[5]。線粒體膜電位的喪失是線粒體凋亡途徑的先決條件。當(dāng)線粒體內(nèi)活性氧大量產(chǎn)生，線粒體膜通透性改變，導(dǎo)致線粒體膜勢(shì)能發(fā)生改變，進(jìn)而引起線粒體釋放Cyt C及細(xì)胞凋亡起始因子(apoptosis initiating factors, AIFs)等，這樣可以激活caspases，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[6]。另外，線粒體外膜通透性的改變也可直接由Bcl-2家族蛋白控制。Ca2+作為第二信使觸發(fā)或者調(diào)控多種細(xì)胞內(nèi)事件而使細(xì)胞執(zhí)行一系列特定的功能。鈣離子不僅參與細(xì)胞凋亡早期Cyt C的釋放和caspase-3的激活，而且也作用于凋亡晚期的DNA裂解[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，PSC833能顯著抑制P-gp的外排功能，增加耐藥細(xì)胞對(duì)其它藥物的敏感性，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的多藥耐藥性[8-9]。但PSC833在DOX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中所致的活性氧與線粒體膜電位的改變均未見(jiàn)報(bào)道。因此，我們進(jìn)一步觀察了PSC833對(duì)K562/DOX細(xì)胞阿霉素、長(zhǎng)春新堿耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，及其對(duì)K562/DOX細(xì)胞凋亡和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，PSC833可劑量相關(guān)性地逆轉(zhuǎn)K562/DOX細(xì)胞對(duì)DOX/VCR的耐藥、明顯增加DOX誘導(dǎo)的K562/DOX細(xì)胞凋亡。本研究利用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)到PSC833和DOX處理后，K562/DOX細(xì)胞活性氧明顯增加，說(shuō)明PSC833誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中活性氧的改變起到了重要的作用?；钚匝醯母淖兛蓪?dǎo)致線粒體膜電位的改變，因此我們利用JC-1熒光探針，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位水平，發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞由Q2向Q4象限移動(dòng)(膜電位降低)，呈一定的劑量依賴性，證實(shí)PSC833和DOX合用可降低線粒體膜電位，由此推測(cè)PSC833的耐藥逆轉(zhuǎn)作用可能是通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用的。[Ca2+]i的升高被認(rèn)為是凋亡的啟動(dòng)環(huán)節(jié)。結(jié)果顯示，K562/DOX細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯升高，[Ca2+]i顯著增加，因此Ca2+作為第二信使也參與了凋亡過(guò)程。線粒體外膜的損傷可以導(dǎo)致Cyt C釋放，與Apaf-1結(jié)合后，形成一個(gè)多聚體即凋亡體，凋亡體募集pro-caspase-9，使其自我激活。Caspase-9前體聚合后被反式催化激活，活化的caspase-9繼而激活下游執(zhí)行caspases(caspase-3、-6、-7)，切割許多重要底物，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)PSC833和DOX合用后，線粒體中Cyt C表達(dá)降低而胞漿中表達(dá)升高，提示凋亡線粒體通路的激活；同時(shí)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，激活cleaved caspase-3而啟動(dòng)了級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PSC833對(duì)K562/DOX細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)作用可能是PSC833抑制P-gp的外排作用，使細(xì)胞內(nèi)DOX濃度增加，增強(qiáng)了DOX的凋亡誘導(dǎo)作用；另一方面，可能降低了P-gp對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，使K562/DOX細(xì)胞更易發(fā)生凋亡，從而介導(dǎo)活性氧升高，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位的降低、[Ca2+]i顯著增加，釋放Cyt C，激活caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

Figure 6. The effect of PSC833 on DOX-induced apoptosis in K562/DOX cells.Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs DOX.

Figure 7. The effect of PSC833 on DOX-induced expression of Cyt C, Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 proteins.1: control; 2: DOX (10 μmol/L); 3: PSC833 (10 μmol/L); 4: PSC833 (2.5 μmol/L)+DOX; 5: PSC833 (5 μmol/L)+DOX; 6: PSC833 (10 μmol/L)+DOX.Mean±SD.n=3.** P<0.01 vs 2.

[參 考 文 獻(xiàn)]

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