李 菲, 黃曉慧, 龔其海, 李銘源, 董紅心,3, 石京山

(1.遵義醫(yī)學院 藥理學教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州 遵義 563099；2.澳門大學 中國醫(yī)學科學研究院， 澳門 000853；3.美國西北大學 精神病學與行為科學實驗室，美國 芝加哥 60611)

淫羊藿又名仙靈脾，為小檗科(Berberidaceae)淫羊?qū)?EpimediumL)植物。據(jù)《中國藥典》記錄，淫羊藿具有很高的藥用價值，性味辛、甘、溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕之功效[1]。淫羊藿主要有效成分之一，淫羊藿苷(icariin, ICA)屬于黃酮類化合物，藥理作用廣泛包括抗腫瘤，促進骨形成，以及保護神經(jīng)元等[2]。ICA在血管系統(tǒng)的突出作用一直備受關(guān)注，表現(xiàn)為抗動脈粥樣硬化、改善血液流變學等[3]。近來文獻報道，ICA在體外可促進人外周血內(nèi)皮祖細胞增殖[4]。然而ICA在整體環(huán)境下是否可促血管生成尚不清楚，本實驗采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚血管受損模型，研究ICA對血管發(fā)生的影響。

1 材料

熒光顯微鏡(Leica熒光顯微鏡，德國Leica公司)；淫羊藿苷(南京澤朗醫(yī)藥技術(shù)有限公司，經(jīng)HPLC測定其純度≥96%)；血管生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(VEGFR Kinase Inhibitor‖, VRI, Clabiochem company/EMD chemicals Inc, cat. no.676481)；所用斑馬魚為Tg(fli-1:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚由澳門大學提供。

2 方法

2.1 斑馬魚的飼養(yǎng) 斑馬魚的飼養(yǎng)方法根據(jù)斑馬魚手冊的描述而設(shè)定。在25 L的反滲水中飼養(yǎng)，水溫控制在攝氏28℃，光照按14 h日光和10 h無光為周期，每天早上9:30開始光照，每日以豐年蝦及熱帶魚糧于早上及下午喂飼2次。

2.2 斑馬魚胚胎的收集 光照后1 h收集胚胎，繼續(xù)培養(yǎng)在反滲水中，溫度28.5℃。于受精后4h保留健康胚胎，挑出未受精及發(fā)育不健全的胚胎。

2.3 模型制備及藥物處理 健康斑馬魚胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至21 h后拆蛋殼，分為6組(每組10～15條，重復2次)，空白對照組(Control)、模型對照組(VRI)、不同濃度ICA處理組(30，100，300 μM)。除空白對照組外，其余4組均給予工具藥血管內(nèi)皮生長因子受體抑制劑(VRI)500 ng·mL-1作用3 h，清洗掉含VRI的培養(yǎng)液[5]，更換為不同濃度的ICA培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 、48 h，用藥結(jié)束后采用熒光顯微鏡觀察。

3 結(jié)果

淫羊藿苷對VRI作用3 h所致斑馬魚胚胎體節(jié)間血管和腸下靜脈受損的影響。VRI作用于斑馬魚胚胎3 h后，將培養(yǎng)液清洗并替換為含有不同濃度ICA的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 、48 h。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)(見圖1)：空白對照組胚胎于24 、48 h均可見完整的體節(jié)間血管，數(shù)量為28±1.9條，幾乎無受損血管，血管綠色熒光清晰明亮。給予VRI作用3 h后的模型對照組胚胎內(nèi)完整的體節(jié)間血管幾乎全部缺失，24 h觀察到殘存的受損血管數(shù)量3.3±2.2條，而48 h后開始恢復，受損血管數(shù)量達9.3±2.2條。給予ICA后能明顯增加完整的體節(jié)間血管數(shù)量，并隨著藥物劑量增加和作用時間延長完整的血管數(shù)量也增多。30 μM的ICA作用24 、48 h斑馬魚所有血管數(shù)量為7.4±2.4和10.9±4.0條；ICA在100 μM時作用24 、48 h后血管數(shù)量為17±2.7和22.3±5.2條；300 μM作用24、48 h后血管數(shù)量分別為23.2±3.1和25.6±2.7條。100和300 μM的ICA給藥組斑馬魚體節(jié)間血管數(shù)量均比模型對照組多，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

n=10～15，重復2次。vs Control, *P<0.05；vs VRI, #P<0.05。VRI：血管內(nèi)皮生長因子受體抑制劑；ICA：淫羊藿苷；ISVs：體節(jié)間血管；SIVs：腸下靜脈；hrs：小時數(shù)；柱狀圖紅色部分：完整的ISVs；藍色部分：不完整的ISVs；縱坐標為血管條數(shù)。 圖1 淫羊藿苷對VRI作用3 h所致斑馬魚胚胎體節(jié)間血管和腸下靜脈受損的影響

ICA對斑馬魚胚胎腸下靜脈的發(fā)生也具有促進作用的趨勢，但不如對體節(jié)間血管的作用明顯，本實驗未對該作用進行量化分析。

4 討論

淫羊藿苷結(jié)構(gòu)清楚屬8-異戊烯黃酮醇苷化合物，分子式C33H40O15，分子量676.67，我室研究發(fā)現(xiàn)ICA在體內(nèi)代謝可誘導藥物代謝Ⅱ相酶的表達[6]。大量體外實驗表明，ICA對血管內(nèi)皮細胞具有積極的促進作用，如提高eNOS活性增加NO的產(chǎn)生而保護血管內(nèi)皮細胞[7]；刺激體外血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管形成[8]；促雞胚尿囊膜模型和牛主動脈內(nèi)皮細胞模型的血管生成[9]；激活內(nèi)皮祖細胞MEK/ERK和PI3K/Akt/eNOS信號途徑刺激血管生成[10]。本實驗結(jié)果提示ICA可促進整體模型轉(zhuǎn)基因斑馬魚的血管發(fā)生。

本實驗采用的Tg(fli-1:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚是一種能在內(nèi)皮細胞中表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的組織特異性轉(zhuǎn)基因斑馬魚[11]，是理想的觀察胚胎血管系統(tǒng)發(fā)育的可視性模型。Tg(fli-1:EGFP)系轉(zhuǎn)基因斑馬魚能表達位于fli-1啟動子上的EGFP序列[12]，而fli-1是一個在小鼠身上廣泛使用的內(nèi)皮細胞標記基因[13]，同時也在斑馬魚胚胎血管發(fā)育時會表達[14]。與活胚胎的微血管攝影技術(shù)相比較，轉(zhuǎn)基因斑馬魚能在不同的時間點，不需要對斑馬魚血管進行任何固定的處理，就能實時地進行血管系統(tǒng)發(fā)育的觀察。因此，在研究有關(guān)血管新生的藥物效應上，Tg(fli-1:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚是一個非常有價值的整體模型。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是血管形成過程中最具特異性的生長因子[15]，其作用的發(fā)揮在于與其受體(VEGF-R)結(jié)合后引發(fā)的一系列信號途徑相關(guān)。本實驗采用血管內(nèi)皮生長因子受體抑制劑(VRI)與轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎共孵育3 h導致斑馬魚胚胎體節(jié)間血管和腸下靜脈幾乎全部缺失，進一步證實了VEGF-R在血管發(fā)生過程中的重要作用。采用不同濃度的ICA治療后，受損的血管逐漸恢復，完整血管的數(shù)量隨藥物劑量的增加和藥物作用時間的延長而增多。而對于ICA促血管發(fā)生的作用機制是在血管內(nèi)皮生長因子受體層面，還是受體前，或受體后的信號調(diào)節(jié)，本實驗未及探討，故對其機制研究仍需繼續(xù)深入。

總之，本實驗結(jié)果證實ICA在整體情況下具有顯著促血管發(fā)生的作用，以此研究為基礎(chǔ)，有望研制開發(fā)一些具有臨床應用價值的藥物，為防治血管缺血性疾病提供一種新的策略。

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