陳大勇，孫麗君

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 婦科,貴州 遵義 563099)

腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥(abdominal incision endometriosis,AIEM)是腹壁切口疤痕處的一種特殊類型的子宮內(nèi)膜異位癥。隨著剖宮產(chǎn)率的增加, 腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生率也在逐年增加[1]。而米非司酮是一種有效、廉價(jià)、可重復(fù)的針對(duì)治療藥物。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)米非司酮治療后，腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶中CD16、CD32和CD64的表達(dá)，以期進(jìn)一步探討米非司酮對(duì)腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶CD16、CD32和CD64的影響及意義。

1 資料與方法

1.1 資料來源

1.1.1 一般資料 收集2005年11月至2011年4月于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科診治的腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥患者40例，年齡21～39歲，病例納入標(biāo)準(zhǔn):確診腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥，在婦科門診規(guī)范治療1～3月后，入院行手術(shù)治療。其中10例術(shù)前未服用米非司酮為對(duì)照組，10例術(shù)前服用米非司酮12.5 mg/d,連服1月為A組，10例術(shù)前服用米非司12.5 mg/d連服3月為B組，10例術(shù)前服用米非司25mg/d連服1月為C組。40例患者均排除內(nèi)分泌及相關(guān)疾病，術(shù)前3個(gè)月未用其它激素類藥物。對(duì)照組月經(jīng)后3～7d于我院行手術(shù)。實(shí)驗(yàn)組服藥結(jié)束后來院手術(shù)。

1.1.2 標(biāo)本的收集及處理 采集術(shù)后腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶組織，投入4%甲醛溶液固定，固定時(shí)間不超過24 h，石蠟包埋后切片，一份用于組織學(xué)分期，一份用于免疫組化染色。

1.1.3 主要試劑 兔抗人CD16多克隆抗體(歐洲santa cruz公司)，兔抗人CD32多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)及兔抗人CD64多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，Envision法鼠抗兔/鼠通用型二抗、DAB顯色劑(Gene tech上海分公司)。米非司酮片，25 mg×6片/盒，北京紫竹藥業(yè)生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶組織中CD16、CD32及CD64的測(cè)定 常規(guī) HE染色鏡檢,根據(jù) Noyes標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分期，所取腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶組織對(duì)照組處于分泌期早期，實(shí)驗(yàn)組均處于增生期。采用免疫組化Envision法，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，CD16抗體有效價(jià)1∶50,CD32抗體有效價(jià)1∶100,CD64抗體有效價(jià)1∶100。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判定 陽(yáng)性為細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，陰性細(xì)胞不著色或著色較淺。用德國(guó)Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每張切片陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值，在40×10的高倍鏡視野下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野取平均值，選取空白區(qū)定標(biāo),測(cè)定每個(gè)視野的平均光密度(AOD)，AOD值越大表明IgGFc受體表達(dá)量越多。

2 結(jié)果

2.1 4組患者一般情況、月經(jīng)周期、剖宮產(chǎn)距本次手術(shù)時(shí)間比較 4組患者的年齡、身高，月經(jīng)周期、前次剖宮產(chǎn)術(shù)距本次手術(shù)時(shí)間分別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

組別年齡(歲)身高(cm)體重(kg)月經(jīng)周期(d)剖宮產(chǎn)時(shí)間(年)*對(duì)照組29.50±2.72158.30±2.4647.55±1.6629.40±2.193.35±1.26A 28.60±2.64156.90±1.9546.80±1.5028.20±1.062.85±1.22B28.40±3.70156.80±1.5048.80±2.1829.10±1.523.10±1.28C27.80±2.18156.80±1.8147.00±1.2228.70±1.622.20±1.00

“*”表示前次剖宮產(chǎn)術(shù)距離本次手術(shù)時(shí)間。

2.2 CD16、CD32、CD64上表達(dá)的平均光密度值比較 4組患者的腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶上均有CD16、CD32、CD64表達(dá)，陽(yáng)性著色部位主要在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)。實(shí)驗(yàn)組CD16、CD32、CD64表達(dá)的平均光密度值表達(dá)量顯著處于高水平，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均<0.001)； CD16、CD32、CD64表達(dá)的平均光密度值，B組顯著高于A組及C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均<0.001)；C組明顯高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.001)，(見表2，圖1)。

組別CD16CD32CD64 對(duì)照組 0.1367±0.02940.1971±0.04500.2111±0.0425A0.2652±0.0395*△0.3782±0.0508*△0.3576±0.0229*△B0.5737±0.0403*△0.6729±0.0229*△ 0.5686±0.0519*△C0.4430±0.0304*△0.5997±0.0356*△0.4202±0.0261*△

與對(duì)照比較，*P<0.001 ； A、B、C組間相互比較△P<0.001。

A:對(duì)照組CD16;B:對(duì)照組CD32;C:對(duì)照組CD64;D:B組CD16;E:B組CD32;F:A組CD64;G:B組CD64;H:C組CD64;均為免疫組織化學(xué)染色(ICH×200)箭頭所指是腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶腺體。圖1 免疫組化技術(shù)檢測(cè)四組患者腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶上CD16、CD32、CD64表達(dá)

2.3 CD16、CD32、CD64表達(dá)與服用米非司酮服用時(shí)間的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)分析檢驗(yàn), 結(jié)果顯示: CD16在腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶上表達(dá)與服用米非司酮時(shí)間的相關(guān)系數(shù)為：r=0.908,P<0.001；CD32在腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶上表達(dá)與服用米非司酮時(shí)間的相關(guān)系數(shù)為：r=0.878,P<0.001；CD64在腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶上表達(dá)與服用米非司酮時(shí)間的相關(guān)系數(shù)為：r=0.949,P<0.001；提示4組患者CD16、CD32、CD64在腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶上的表達(dá)與服用米非司酮時(shí)間均呈正相關(guān)。對(duì)于米非司酮服用時(shí)間，實(shí)驗(yàn)組患者CD16、CD32、CD64在腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶上表達(dá)的平均光密度的比較，服用1月組與服用3月組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.001)。

2.4 CD16、CD32、CD64表達(dá)與服用米非司酮日服用量的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)分析檢驗(yàn), 結(jié)果顯示: CD16在腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶上表達(dá)與米非司酮日服用量的相關(guān)系數(shù)為：r=0.625,P<0.001；CD32在腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶上表達(dá)與米非司酮日服用量的相關(guān)系數(shù)為：r=0.734,P<0.001；CD64在腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶上表達(dá)與米非司酮日服用量的相關(guān)系數(shù)為：r=0.539,P<0.001；提示4組患者CD16、CD32、CD64在腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶上的表達(dá)與米非司酮日服用量均呈正相關(guān)。對(duì)于米非司酮日服用量，實(shí)驗(yàn)組患者CD16、CD32、CD64在腹壁切口子宮內(nèi)膜異位病灶上表達(dá)的平均光密度的比較，服用米非司酮12.5mg/d組與服用米非司酮25mg/d組間兩兩比較，CD16，P=0.897；CD32,P=0.152；CD64,P=0.325,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥(AIEM)是子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)的一種特殊類型，常發(fā)生于剖宮產(chǎn)手術(shù)切口，主要由于手術(shù)后活性子宮內(nèi)膜及間質(zhì)組織局部種植引起。而機(jī)體不能識(shí)別異位的子宮內(nèi)膜組織可能是由于患者免疫耐受的增強(qiáng)[2]。其中90 %異位種植組織由白細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1 (leukocyte function-associated antigen-1 ,LFA-1) 介導(dǎo)促使白細(xì)胞吞噬及誘導(dǎo)異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡;另10 %因機(jī)體腹腔巨噬細(xì)胞、自然殺傷性細(xì)胞(natural killer cell ,NK) 免疫功能缺陷,在某些細(xì)胞因子、粘附分子、生長(zhǎng)因子的作用下發(fā)生子宮內(nèi)膜碎片與腹膜間皮細(xì)胞粘附而存留,進(jìn)一步侵襲生長(zhǎng),形成局部結(jié)節(jié)樣病灶[3]。引起月經(jīng)期局部腫脹、疼痛。嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。

本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組患者體內(nèi)IgG重鏈Fc段受體(Fc γR)處于低水平。AIEM局部CD16+、CD32+、CD64+細(xì)胞減少，提示Ems患者免疫功能低下，尤其是細(xì)胞免疫功能低下[4]。FcγR Ⅰ(CD16)、FcγR Ⅱ(CD32)、FcγR Ⅲ(CD64)是免疫效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)的能夠結(jié)合免疫球蛋白G(IgG)重鏈(γ)的Fc部分的膜蛋白。FcγR 可以通過抗體Fc區(qū)與抗原-IgG抗體復(fù)合物(免疫復(fù)合物, IC)結(jié)合,引發(fā)多種細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)。而低水平FcγR不足以與AIEM患者血清中存在子宮內(nèi)膜抗體(EmAb)IgG及IgM[5]產(chǎn)生免疫效應(yīng)，因此不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生活性效應(yīng)細(xì)胞及釋放多種細(xì)胞因子，無(wú)法誘發(fā)局部慢性炎癥反應(yīng)，引起局部病灶壞死及凋亡，從而無(wú)法起到清除局部病灶組織的作用。

本研究結(jié)果顯示在腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥(AIEM)患者異位內(nèi)膜均檢出有少量FcγR陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，CD16、CD32、CD64在異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平明顯偏低。有研究顯示子宮內(nèi)膜CD57+CD16+適度分化的NK細(xì)胞減少[6]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示局部FcγR陽(yáng)性細(xì)胞不足，不足以誘導(dǎo)B細(xì)胞活化及T細(xì)胞克隆，使得局部處于免疫忽視狀態(tài)，導(dǎo)致局部異位內(nèi)膜組織不能被有效清除，從而繼續(xù)侵襲生長(zhǎng)，導(dǎo)致本病的發(fā)生發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥異位子宮內(nèi)膜處CD16、CD32、CD64陽(yáng)性細(xì)胞在服用米非司酮組較對(duì)照組升高。與祝紅霞等[7]發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致。說明服用米非司酮能上調(diào)AIEM異位病灶處FcγR陽(yáng)性細(xì)胞的水平，增強(qiáng)局部細(xì)胞免疫及體液免疫，促進(jìn)局部T細(xì)胞的殺傷及吞噬作用，引起局部子宮內(nèi)膜破壞和凋亡，軟化病灶，減小病灶體積，達(dá)到治療效果。這可能是米非司酮治療腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥的又一機(jī)制。

FcγR陽(yáng)性細(xì)胞在腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜表達(dá)與米非司酮的日服用量時(shí)間呈正相關(guān)(P均<0.001)。但對(duì)于米非司酮日服用量，服用米非司酮12.5mg/d組與服用米非司酮25mg/d組間兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了米非司酮是以劑量依賴來達(dá)到治療子宮內(nèi)膜異位癥，小劑量米非司酮仍能達(dá)到治療效果[8]。

FcγR陽(yáng)性細(xì)胞在腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜表達(dá)與米非司酮的服用時(shí)間呈正相關(guān)(P<0.001)。對(duì)于米非司酮日服用時(shí)間，服用米非司酮1月組與服用米非司酮3月組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了米非司酮是以時(shí)間依賴來達(dá)到治療子宮內(nèi)膜異位癥，服用時(shí)間越長(zhǎng)療效越理想。但長(zhǎng)期服用(3月以上)米非司酮可引起子宮內(nèi)膜單純性增生，發(fā)生率與服用時(shí)間成正比[9],故長(zhǎng)期服用應(yīng)進(jìn)行子宮內(nèi)膜的檢查[10]。

綜上所述，米非司酮能上調(diào)腹壁切口異位癥異位內(nèi)膜局部FcγR陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)水平，小劑量及中長(zhǎng)期服用米非司酮治療腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥療效較理想，提示腹壁切口異位癥異位內(nèi)膜局部FcγR陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的變化在米非司酮的治療機(jī)制中可能起一定作用。子宮內(nèi)膜異位癥與免疫因素有著極其密切的關(guān)系。腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥異位病灶處的FcγR陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)處于低水平,這

可能是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位種植引起子宮內(nèi)膜異位癥的因素之一。這為針對(duì)FcγR開展免疫靶向干預(yù)治療子宮內(nèi)膜異位癥提供新的方向。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 冷金花,史精華. 子宮內(nèi)膜異位癥對(duì)生育的影響和治療對(duì)策[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志：電子版, 2012,6(3):548-550.

[2] May K E , Villar J , Kirtley S ，et al. Endometrial alterations in endometriosis: a systematic review of putative biomarkers[J]. Human Reproduction Update， 2011,17(5):637-653.

[3] 周秋明,吳元赭 ,沙金燕.細(xì)胞粘附分子與盆腔子宮內(nèi)膜異位癥關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2014, 17( 1):78-80.

[4] Gallinelli A,Chiossi G,Gannella L,et al.Different concentrations of interleukins in the peritoneal fluid of women with endometriosis:relationships with lymphocyte subsets[J].Gynecol Endocrinol,2004,18(3):144-151.

[5] Gajbhiye R,Suryawanshi A,Khan S.Multiple endometrial antigens are targeted in autoimmune endometriosis[J].Reprod Biomed Online,2008,16(6):817-824.

[6] May K E , Conduit-Hulbert S A , Villar J,et al.Peripheral biomarkers of endometriosis: a systematic review[J]. Human Reproduction Update, 2010,16(6): 651-674.

[7] 祝紅霞,張武文,黃麗麗. 低劑量米非司酮對(duì)人植人窗期子宮內(nèi)膜自然殺傷細(xì)胞數(shù)量及其亞型的影響[C].第三次全國(guó)婦產(chǎn)科中青年醫(yī)師學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編,2007:232.

[8] 馬成斌，劉平，曹美良，等. 盆腔子宮內(nèi)膜異位癥術(shù)后應(yīng)用不同劑量米非司酮治療的療效觀察[J].中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2007，23(1)：61-63.

[9] Eisinger S H，Bonfiglio T，F(xiàn)iscella K，et a1.Twelve—month safety and efficacy of low —dose mifepristone for uterine my0mas[J].Min Invasive Gynecol，2005，12(3)：227-233.

[10] Spitz I M，Grunberg S M，Chabbert—Buffet N，et a1.Management of patients receiving long- term treatment with mifepristone[J].Fertil Steril，2005，84(6)：l719-1726.