馮永懷，吳柳松，馮子芳，肖慶邦，陳 琦

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 生物化學教研室，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099)

惡性淋巴瘤是一組源于淋巴結(jié)和結(jié)外部位淋巴組織的免疫細胞腫瘤，具有廣泛浸潤組織器官的特點，彩色多普勒可觀察到腫瘤組織有豐富的血流信號。彌漫性大B細胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma，NHL)最常見的類型，在西方國家約占成人NHL 的30%～40%，在我國其構(gòu)成比更高。腫瘤的侵襲播散與細胞外基質(zhì)的降解和腫瘤的血管生成有著密切相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF) 是一種促血管生成因子，是腫瘤微血管形成的最重要調(diào)節(jié)因子?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMP)家族成員眾多，MMP-9是其中的重要成員，也是近年來的研究熱點，它主要通過降解細胞外基質(zhì)，對腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移起重要作用。許多實驗研究表明，VEGF不僅在許多實體瘤中表達上調(diào)，還與這些腫瘤的預后相關(guān)，因此常被作為一些腫瘤的治療靶點。但對VEGF與DLBCL發(fā)病及侵襲轉(zhuǎn)移的報道不多。我們應用Envision免疫組化法檢測DLBCL及良性反應性增生淋巴結(jié)組織中VEGF及MMP-9的表達情況，以探討MMP-9、VEGF與DLBCL發(fā)病、侵襲惡化之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 2009年1月至2013年1月在遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院收治的經(jīng)病理組織學確診的DLBCL65例，診斷標準參照新版WHO 關(guān)于淋巴造血組織腫瘤分類(2008)[1]。臨床分期按Ann Arbor-Colswolds分期標準：I期4例，Ⅱ期7例，Ⅲ期35例，Ⅳ期19例，發(fā)病部位結(jié)外23例，結(jié)內(nèi)42例；按伴隨癥狀分為A組16例，B組(伴發(fā)熱、盜汗、消瘦等癥狀者)49例，所有患者術(shù)前未經(jīng)放療和化療。20例淋巴結(jié)反應性增生作為對照組，其中包括13例男性，7例女性，年齡在16～72歲，中位年齡為51歲。

1.2 試劑 人MMP-9、VEGF多克隆抗體均購自廣州華拓生物科技有限公司，濃度均為1∶100；試劑盒、DAB顯色劑等均購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.3 方法 采用Envision免疫組織化學染色法。將3～4μm的石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，加3% H2O2處理，于枸櫞酸緩沖液(pH6.0)中高壓修復，滴加一抗放4℃冰箱冷藏過夜后，滴加生物素化二抗，DAB顯色。蘇木精復染，脫水透明、封片。選擇試劑公司提供的MMP-9陽性、VEGF陽性的切片作為陽性對照，使用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷 MMP-9 、VEGF的陽性信號均為淡黃色或棕黃色，主要定位于細胞質(zhì)。隨機選擇5個高倍視野，合并計算所分析的不同視野的染色強度及染色細胞百分數(shù)，據(jù)顯色深淺計分及陽性細胞百分率計算[2]：①顯色深淺:不顯色或顯色不清為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；深褐色為3分。②陽性細胞的百分率：陽性細胞率0%～5% 計0分；5%>～10%計1分；10%>～50% 計2分；50%>～75%計3分；>75%計4分。顯色深淺評分與陽性細胞百分率相乘，0～3分為陰性(-)，3～6分為弱陽性(+)，6～9分為中等陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用2檢驗,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-9在腫瘤細胞及反應性增生淋巴結(jié)組織中的表達 MMP-9在DLBCL組織中的陽性表達率為78.46%(51/65) ；MMP-9在淋巴結(jié)反應性增生組織中的陽性表達率為15%( 3 /20)；兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1，圖1A，圖1B)。

2.2 VEGF在腫瘤細胞及反應性增生淋巴結(jié)組織中的表達 VEGF在DLBCL組織中的陽性表達率為67.69%(44/65) ；VEGF在淋巴結(jié)反應性增生組織中的陽性表達率為5%(1 /20)；兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1，圖1C，圖1D)。

2.3 MMP-9、VEGF在DLBCL中的表達與臨床指標之間的關(guān)系 MMP-9、VEGF在DLBCLⅢ期、Ⅳ期的表達量高于Ⅰ期、Ⅱ期(P<0.05)；伴有發(fā)熱、盜汗、消瘦等B癥狀的B組患者其VEGF的表達高于不伴以上癥狀的A組患者(P<0.05)，MMP-9的表達與是否伴有B癥狀無關(guān)(P>0.05)；MMP-9、 VEGF的表達均與DLBCL是否累及結(jié)外組織無差異性(P>0.05)(見表2)。

表1 MMP-9、VEGF在DLBCL腫瘤細胞及反應性增生淋巴結(jié)組織中的表達

組別例數(shù)MMP-9陽性陰性PVEGF陽性陰性DLBCL6551144421Lymphocytes20317119

DLBCL與Lymphocytes比較P<0.05。

A：MMP-9在DLBCL呈陽性表達(IHC ×200)；B：MMP-9在淋巴結(jié)反應性增生中呈陰性表達(IHC ×400)；C：VEGF在DLBCL呈陽性表達(IHC ×400)；D：VEGF在反應性淋巴結(jié)增生中呈陰性表達(IHC ×400)。圖1 MMP-9、VEGF在DLBCL和淋巴結(jié)反應性增生中表達

表2 DLBCL中MMP-9、VEGF的表達及與臨床指標之間的關(guān)系

臨床指標例數(shù)MMP-9陽性陰性PPVEGF陽性陰性P臨床分期Ⅰ&Ⅱ期1165<0.0547<0.05 Ⅲ&Ⅳ期544594014分組A16124>0.05610<0.05B4939103811結(jié)外組織累及情況結(jié)內(nèi)423210>0.052913>0.05結(jié)外23194158

2.4 DLBCL中MMP-9的表達與VEGF表達的差異性比較采用配對2檢驗分析DLBCL中MMP-9和VEGF之間表達的差異性，可知VEGF表達和MMP-9的表達無差異性(2= 0.94，P>0.05) (見表3)。

表3 DLBCL中MMP-9的表達與VEGF表達的差異性

VEGFMMP-9+-+3311-183

VEGF、MMP-9比較P>0.05。

3 討論

彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)中最常見的一種，在歐美國家的發(fā)病率約占NHL的30%，在亞洲國家發(fā)病率則更高，約占B細胞淋巴瘤的50%左右。DLBCL具有惡性程度高，侵襲性強，治愈率低的特點，嚴重危害人類健康。

MMP家族成員與腫瘤的進展關(guān)系一直以來備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，很多MMP-9家族成員與腫瘤的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。MMP-9是目前研究較多的一類基質(zhì)金屬蛋白酶，它與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切。對人體多種腫瘤進行研究，結(jié)果表明在不同實體瘤中MMP-9有不同程度的增高，并與腫瘤進展及預后相關(guān)。MMP-9與淋巴瘤之間關(guān)系的研究主要集中在NHL，認為MMP-9、MMP-2及MMP-26在NHL中高表達，并與Ann Arbor臨床分期相關(guān)，與惡性淋巴瘤的高侵襲性密切相關(guān)[2,11]，而對于占NHL中較大比例的DLBCL而言，研究尚少。趙文輝等[9]的研究表明MMP-9與NHL生存期呈負相關(guān)，是其預后差的指標。本研究結(jié)果表明，DLBCL中MMP-9的表達高于正常淋巴組織，且與DLBCL的臨床分期有關(guān)，進一步證實MMP-9與DLBCL的發(fā)病、侵襲進展乃至預后都可能有著較為密切的關(guān)系。

腫瘤的侵襲播散與細胞外基質(zhì)的降解和腫瘤的血管生成密切相關(guān)。VEGF是具有高度特異性的血管內(nèi)皮細胞有絲分裂素，被認為是最強的促血管生成因子，研究表明其在許多腫瘤組織中高表達，能促進腫瘤細胞血管生成，在肺癌、膽管癌、腸癌等諸多腫瘤中均有表達[3-5]。近年來，許多實驗研究表明，淋巴瘤中存在VEGF的廣泛表達[6-7]，并與淋巴瘤預后有關(guān)。張貴鵬等[8]通過檢測血漿中的VEGF，發(fā)現(xiàn)初治DLBCL患者血漿中的VEGF顯著高于正常對照組，VEGF的高表達不僅與療效存在相關(guān)性，還可能參與了DLBCL細胞耐藥。趙文輝[9]等檢測了VEGF在非何杰金淋巴瘤的表達，發(fā)現(xiàn)67.69%的標本中有VEGF的陽性表達，不同的病理類型中VEGF的表達亦不同，提示VEGF的表達可能與淋巴瘤惡性程度有關(guān)。我們應用免疫組化方法檢測了VEGF在DLBCL組織中呈高表達，結(jié)果顯示DLBCLⅢ期、Ⅳ期的表達量高于Ⅰ期、Ⅱ期，且具有B癥狀DLBCL患者VEGF的表達增高。提示VEGF的表達可能與淋巴瘤的侵襲性有關(guān)，這與趙文輝[9]、朱江等[10]的研究結(jié)果相符。VEGF在DLBCL中的高表達可能賦予腫瘤細胞強的增殖能力及侵襲能力，檢測VEGF對判斷DLBCL的生物學行為有幫助。

綜上，MMP-9、VEGF在DLBCL均呈高表達，它們的表達均與DLBCL臨床分期有關(guān)，在Ⅲ、Ⅳ期患者陽性表達率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者；VEGF在陽性率表達率還與伴發(fā)癥狀有關(guān)，因而認為MMP-9、VEGF均參與了DLBCL的發(fā)生、發(fā)展，可能與淋巴組織惡變有關(guān)。

[參考文獻]

[1] Swerdlow S H,Campo E,Harris N L,et al. WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues[M].4th ed.IARC press: Lyon,2008:285-288.

[2] 鐘美佐,黃進,翟曉,等.MMP-9、MMP-2在非霍奇金淋巴瘤病理組織中的表達及意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2006,14(2):218-220.

[3] 錢海紅.非小細胞肺癌化療前后血清VEGF和MMP-9水平的對照觀察[J].河北醫(yī)藥,2013,35(4):496-497.

[4] 姚旭,劉源,王勇,等.Gab1與MMP-9在膽管癌中的表達及意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2013,21(1):118-121.

[5] 吳婧婧,顧康生.小腸腺癌患者中 MMP-9、Ki-67、EGFR和VEGF的表達與臨床特征及預后的相關(guān)性研究[J].安徽醫(yī)科大學學報,2013,48(6):647-651.

[6] Passam F H,Alexandrakis M G,Kafousi M,et al. Histological expression of angiogenic factors: VEGF,PDGFRα,and HIF-1αlpha in Hodgkin lymphoma[J].Pathol Res Pract,2009,205(1):11-20.

[7] 蘇俊,侯文.IFN-γ及VEGF在經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及H/R-S細胞與背景細胞關(guān)系的探討[J].遵義醫(yī)學院學報,2011,34( 4):361-366.

[8] 張貴鵬,王占聚,崔為發(fā),等.彌漫性大B細胞淋巴瘤IL-6 和VEGF表達水平與化療耐藥的相關(guān)性[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012,28 (4):488-489.

[9] 趙文輝,張清媛,康新梅,等.MMP-9、VEGF、bFGF在非何杰金淋巴瘤的表達及臨床意義[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2006,7(6):17-18.

[10] 朱江,王威亞,蔣明,等.非霍奇金淋巴瘤VEGF表達與臨床特征的關(guān)系初探[J].四川大學學報：醫(yī)學版,2008,39(3):418-420.

[11] 馮永懷,吳柳松,蘇俊，等. MMP-26、TIMP-4和MMP-9在彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達及意義[J].中國實驗血液學雜志,2013,21(5):1167-1172.