楊加偉，李 偉，葛正龍

(遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

植物生物反應(yīng)器具有操作簡便、產(chǎn)物活性高、成本低、易擴(kuò)大規(guī)模等優(yōu)點(diǎn)，與微生物及動物細(xì)胞等其它生物反應(yīng)器相比有獨(dú)特的優(yōu)勢，因此在細(xì)胞因子、生長因子、抗體及疫苗等藥用蛋白制造領(lǐng)域獲得了廣泛的研究和應(yīng)用[1]。白細(xì)胞介素(IL)是一類體內(nèi)含量極微的細(xì)胞因子，多為小分子糖蛋白，在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化，以及在炎癥反應(yīng)中均起著重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)30多種。其中IL-12是由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌表達(dá)的一種細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)活性，在機(jī)體的抗腫瘤、抗病毒、抗過敏過程中均發(fā)揮著極其重要的作用，在臨床上有著巨大的應(yīng)用前景[2]。目前，雖已有商品化的重組IL-12出售，但價格極其昂貴，因此利用植物生物反應(yīng)器高效表達(dá)生產(chǎn)IL-12，降低IL-12的生產(chǎn)成本，具有重大的應(yīng)用價值。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，構(gòu)建了CaMV-35S啟動子驅(qū)動的hIL12表達(dá)載體并導(dǎo)入馬鈴薯基因組，獲得了表達(dá)hIL12的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株，體外實(shí)驗(yàn)表明重組hIL12具有生物學(xué)活性，但表達(dá)量較低[3-4]。利用植物自身的組織特異性強(qiáng)啟動子替代CaMV-35S等組成型啟動子來驅(qū)動外源基因的表達(dá)，是提高重組蛋白表達(dá)量的有效途徑[5]。馬鈴薯PATATIN蛋白是一類分子量約為40 kD的糖蛋白，其在馬鈴薯塊莖可溶性總蛋白中的含量高達(dá)40%，而在其它組織中的含量極少[6]。因此，本研究擬從馬鈴薯基因組中克隆驅(qū)動patatin基因高效表達(dá)的組織特異性啟動子(Ppatatin)，并對克隆的啟動子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，然后構(gòu)建其驅(qū)動的植物表達(dá)載體，為其在馬鈴薯生物反應(yīng)器中的應(yīng)用和提高h(yuǎn)IL12的表達(dá)量打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑 本研究用馬鈴薯材料中薯1號，由遵義市農(nóng)科所提供。主要試劑有PCR反應(yīng)液(Takara公司)、限制性內(nèi)切核酸酶及DNA連接酶(Takara公司)、質(zhì)粒提取試劑盒(TIANGEN公司)、瓊脂糖(西班牙)等?？寺y序載體為pMD-18T，購買于Takara公司；雙元表達(dá)載體pCAMBIA2301-MCS由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所贈送；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購于TIANGEN公司；質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hIL-12HSP70由本實(shí)驗(yàn)室保存。所用PCR引物由上海生工公司合成，引物序列(見表1)。

表1引物序列

引物名稱引物序列 酶切位點(diǎn)Ppatatin-fCCGGAAGCTTTGCGTATTAGTTTTAGCGACGAHind IIIPpatatin-rCCCCGTCGACGTTGGTGCTTTGAGCATATAACSal IhIL12-fCAACGTCGACGGGGCAAGATGTGTCACCAGCAGSal IhIL12-rCCGGGAGCTCTTAGGAAGCATTCAGATAGCSac I

1.2 DNA提取 使用改良的CTAB法提取基因組DNA，取馬鈴薯塊莖0.5 g于液氮中研磨粉碎，轉(zhuǎn)入離心管，加入5 mL CTAB提取液，65 ℃加熱30 min后，12 000 rpm離心10min。取上清，加入等體積的酚/氯仿抽提2次，取上清并加入等體積的異丙醇常溫沉淀5 min，12 000 rpm離心5 min，棄上清，沉淀中加入5 mL 70%乙醇洗滌沉淀2次，最后完全棄除液體風(fēng)干，加入100 μL TE/RNase緩沖液，-70 ℃保存。

1.3 PCR擴(kuò)增 以基因組DNA或質(zhì)粒為模板，利用表1的引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：模板50 ng、10×buffer 5 μL、dNTPs(10 mmol L-1)1 μL、引物(10 μmol L-1)各1 μL、Taq酶1 U、補(bǔ)水至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50～58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；72 ℃充分延伸10 min。擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為26～30次。

1.4 啟動子序列分析 序列同源性分析比對在NCBI網(wǎng)站BLAST頁面(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行，啟動子核心區(qū)序列及相關(guān)調(diào)控元件分析利用數(shù)據(jù)庫Neural Network Promoter Prediction(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)以及植物順式調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/ signalscan.html)和PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare.html)完成。

1.5 表達(dá)載體構(gòu)建 利用引物Ppatatin-f和Ppatatin-r從基因組DNA中擴(kuò)增Ppatatin啟動子序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測后割膠回收并連接T載體，送予上海生工公司進(jìn)行序列測定。利用引物IL12-f和IL12-r從本實(shí)驗(yàn)室保存的pIRES2-EGFP-hIL-12HSP70載體中擴(kuò)增出hIL12基因序列并回收。接著，以Ppatatin-f+hIL12-r為引物，以回收的Ppatatin啟動子片段和hIL12基因片段為模板，利用重疊PCR技術(shù)，擴(kuò)增獲得Ppatatin啟動子+hIL12基因片段。用Hind III和SacI限制性內(nèi)切酶酶切目的片段和表達(dá)載體pCAMBIA2301-MCS?；厥障鄳?yīng)片段后T4 DNA連接酶連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法參見文獻(xiàn)[7]。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)、酶切鑒定陽性克隆后，送予上海生工公司進(jìn)行序列測定以確保序列正確，重組載體示意圖(見圖1)。

圖1 表達(dá)載體示意圖

2 結(jié)果

2.1 馬鈴薯基因組DNA提取和啟動子Ppatatin的獲得 利用CTAB法，順利提取了馬鈴薯基因組DNA(見圖2A)。為獲得最佳的PCR擴(kuò)增效率，本研究對引物退火溫度進(jìn)行了摸索并設(shè)計了退火溫度梯度，分別為55 、56、58、59 °C。結(jié)果顯示，退火溫度為55～56 °C時擴(kuò)增效果最好，獲得了約1000 bp大小的Ppatatin條帶，且條帶整齊、亮度集中(見圖2B)。故以此為退火溫度進(jìn)行大量擴(kuò)增后回收片段，通過T-A克隆技術(shù)，將目的片段導(dǎo)入pMD-18T載體，酶切鑒定(圖2C)正確后進(jìn)行測序分析。

A：馬鈴薯基因組DNA電泳圖，1：λDNA標(biāo)準(zhǔn)品(100 ng)；2：馬鈴薯基因組DNA；B：不同退火溫度下Ppatatin擴(kuò)增效果；1～4分別是退火為55、56、58、59 °C時的PCR擴(kuò)增條帶，箭頭所示為目標(biāo)條帶，下同；C：pMD-18T- Ppatatin重組質(zhì)粒Hind III+ Sal I雙酶切檢測電泳圖，1～4為不同單克隆。圖2 Ppatatin擴(kuò)增與T-A克隆鑒定電泳圖

2.2 啟動子Ppatatin序列鑒定和元件分析 通過DNA 測序表明所克隆的Ppatatin啟動子序列大小為1019 bp，序列GC含量較低，僅為31.89%。搜索Genebank數(shù)據(jù)庫中的同源序列，表明本研究克隆的序列與GeneBank中已公布的同源序列的一致性為98%以上。采用Neural Network Promoter Prediction 啟動子數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能預(yù)測，結(jié)果表明克隆到的Ppatatin序列存在2處核心啟動子區(qū)域(見表2)，并且得分較高(總分為1分)，表明該序列具有啟動子功能。

表2 Ppatatin序列的核心啟動子區(qū)

利用PLACE 及PlantCare 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線預(yù)測，分析啟動子的功能元件和重要調(diào)控區(qū)，結(jié)果顯示(見圖3)：在-52至-45 bp、-211至-205 bp以及-218至-213 bp處有3個TATA-box，其功能是保證轉(zhuǎn)錄得以精確起始；在-240至-235 bp及-405至-401 bp處有2個CAAT-box，決定著啟動子的起始頻率和強(qiáng)度。除了含有TATA-box和CAAT-box2個典型的啟動子元件外，該序列還有多個與糖響應(yīng)相關(guān)元件，包括：2個SURE1和2個SURE2蔗糖效應(yīng)元件，分別位于-193至-184 bp、-513至-504 bp以及-206至-196 bp、-526至-516 bp處，這4個元件是馬鈴薯塊莖中patatin基因啟動子的保守調(diào)控序列；另有2個CGACGOSAMY3糖相關(guān)元件，位于-12至-8 bp和-1003至-999 bp處。有2個莖部特異表達(dá)相關(guān)元件：NODCON1GM 和NODCON2GM，分別位于-668至-663 bp和-788至-784 bp處。還有4個與儲藏蛋白表達(dá)相關(guān)的EBOXBNNAPA順式元件，分別位于-951至-946 bp、-452至-447 bp、-419至-414 bp和-160至-155 bp處；以及2個儲藏物特異調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)B-box，分別位于-604至-594 bp和-246至-236 bp處。此外，該序列中還發(fā)現(xiàn)了與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育相關(guān)的一些應(yīng)激元件，例如：光反應(yīng)元件ATCT-motif(-865至-856 bp)、AAAC-motif(-335至-324 bp)和G-box(-60至-55 bp)；與逆境相關(guān)的ABA應(yīng)答元件ABRELATERD1(-770至-766 bp)等。以上分析結(jié)果表明該片段不僅具有完整的啟動子表達(dá)調(diào)控元件，還具有與組織特異性相關(guān)的特異序列，而這些序列也正是驅(qū)動馬鈴薯patatin基因特異性表達(dá)所必須的。

圖3 Ppatatin序列分析

2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建 本研究首先以pIRES2-EGFP-hIL-12HSP70載體質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得了大小約為1.6 kb的hIL12基因片段(見圖4A，泳道2)。接著，利用重疊PCR技術(shù)，將Ppatatin片段和hIL12基因片段合成在一起，獲得了約2.6 kb的Ppatatin+hIL12基因片段(見圖4A，泳道3)。接著，通過雙酶切將母本載體pCambia2301-MCS上的CaMV-35S啟動子切下，結(jié)果顯示獲得了大小約為12 kb載體片段和600 bp的CaMV-35S片段(圖4B)，回收載體片段。通過體外連接，將Ppatatin+hIL12基因片段裝入表達(dá)載體(載體示意圖見圖1)。挑選7個轉(zhuǎn)化后的單克隆重組子提取質(zhì)粒后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，結(jié)果顯示(見圖4C)，重組子1、3、7、8的質(zhì)粒經(jīng)酶切后，檢測到了大小約12 kb的載體片段和2.5 kb的目的片段，表明其為陽性克隆，證實(shí)載體構(gòu)建成功。

A：啟動子Ppatatin1、hIL12基因2和Ppatatin+hIL12 3片段電泳圖，條帶大小分別為1、1.6、2.6 kb；B：pCambia2301-MCS載體Hind III+ Sac I雙酶切電泳圖；C：重組表達(dá)載體Hind III+ Sac I雙酶切鑒定電泳圖，1～8為不同單克隆。圖4 表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定電泳圖

3 討論

目前，用于重組藥用蛋白研究和生產(chǎn)的生物反應(yīng)器有原核生物反應(yīng)器[8]、酵母生物反應(yīng)器[9]、動物生物反應(yīng)器[10]和植物生物反應(yīng)器[1]。相比于微生物反應(yīng)器，植物生物反應(yīng)器由于具有與動物細(xì)胞相似的真核基因表達(dá)機(jī)制，表達(dá)的蛋白更易具有生物學(xué)活性；而和動物反應(yīng)器相比，植物細(xì)胞培養(yǎng)簡單，且轉(zhuǎn)基因體系成熟。鑒于植物生物反應(yīng)器的各種優(yōu)越性，開發(fā)植物生物反應(yīng)器表達(dá)具有應(yīng)用價值和應(yīng)用潛力的藥用蛋白受到了許多科研工作者的重視[1, 5,11]。但是，相比于微生物反應(yīng)器的高效性，植物表達(dá)系統(tǒng)的外源蛋白表達(dá)量太低[5， 12]，大大限制了其發(fā)展。啟動子是決定外源蛋白能否高表達(dá)的重要因素，而選擇利用組織特異性的強(qiáng)啟動子驅(qū)動外源基因，在植物的某一特定組織內(nèi)獲得高表達(dá)重組蛋白，是優(yōu)化植物生物反應(yīng)器的途徑之一[5]。因此，本研究選用馬鈴薯塊莖特異表達(dá)的高效啟動子Ppatatin驅(qū)動hIL12的表達(dá)，期望在下一步的研究中獲得馬鈴薯塊莖中特異性高表達(dá)的重組hIL12，在前期研究[3-4]的基礎(chǔ)上提高h(yuǎn)IL12的表達(dá)量。

本研究通過Genebank數(shù)據(jù)庫搜索patatin基因及其啟動子序列，采用生物信息學(xué)分析和比較，設(shè)計特異性的引物從馬鈴薯品種中薯1號中成功獲得了大小為1019 bp的目的序列，經(jīng)與數(shù)據(jù)庫同源序列比對表明patatin基因啟動子區(qū)序列呈現(xiàn)高度保守。通過生物信息學(xué)手段對該序列分析和預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該序列具有2處核心啟動子區(qū)域，具有啟動子的特征。在序列結(jié)構(gòu)上，該序列含有TATA-Box、CAAT-Box等轉(zhuǎn)錄起始必需元件外，含有4個蔗糖效應(yīng)元件，2個糖相關(guān)元件，這和PATATIN蛋白的表達(dá)受到蔗糖誘導(dǎo)相符[13]。該序列還含有2個莖部特異表達(dá)相關(guān)元件、4個與儲藏蛋白表達(dá)相關(guān)元件以及2個儲藏物特異調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)，符合PATATIN蛋白是馬鈴薯塊莖的儲藏蛋白這一特點(diǎn)[14]。

除了啟動子因素外，高效和穩(wěn)定的植物表達(dá)載體也是外源蛋白高表達(dá)的重要決定因素。本研究選用的pCambia系列載體是轉(zhuǎn)基因植物研究時最常用的表達(dá)載體，該載體含有左右2個T-DNA邊界，邊界內(nèi)的序列能整合到植物基因組中的隨機(jī)位置[15-16]。本研究的基礎(chǔ)載體pCambia2301-MCS是在pCambia-2301的多克隆位點(diǎn)區(qū)加入了組成型啟動子CaMV-35S和NOS終止子。因此，本研究首先利用限制性內(nèi)切酶將載體上的CaMV-35S啟動子切下后，再導(dǎo)入啟動子Ppatatin和hIL12基因片段。此外，本研究利用重疊PCR技術(shù)將Ppatatin片段和hILl2片段拼裝在一起后，將2個片段一步連接到母本載體，省去了一步體外連接及轉(zhuǎn)化的操作，簡化了載體構(gòu)建過程。

綜上所述，本研究從馬鈴薯中克隆了塊莖特異性高表達(dá)的patatin基因啟動子并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，然后成功構(gòu)建了其驅(qū)動的hIL12植物表達(dá)載體，對提高h(yuǎn)IL-12在馬鈴薯中的表達(dá)量和優(yōu)化馬鈴薯生物反應(yīng)器中在藥用蛋白表達(dá)中的應(yīng)用具有一定的意義。

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