呂延成，潘曉瑜，黃 暢，丁 娟

(遵義醫(yī)學院 珠海校區(qū)，廣東 珠海 519040)

Ⅱ型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus type 2, HSV-2)是人類常見疾病的病原體之一，主要引起生殖器部位或新生兒感染。HSV-2的UL54和UL29基因在病毒感染過程中起重要作用，為HSV-2病毒復(fù)制所必需。UL54基因?qū)儆贖SV-2立即早期基因，編碼的ICP27蛋白是一種多功能蛋白，主要調(diào)節(jié)病毒和宿主細胞mRNA的合成、成熟和運輸[1]，ICP27蛋白一旦突變可影響病毒在宿主內(nèi)的復(fù)制[2-3]。UL29基因編碼ICP8蛋白屬單鏈DNA結(jié)合蛋白，參與病毒復(fù)制過程中的DNA解鏈， ICP8蛋白表達受到抑制可影響HSV-2晚期基因的表達[4-6]。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA介導(dǎo)的一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。針對目標基因設(shè)計、構(gòu)建帶有啟動子的重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)錄出短發(fā)夾鏈RNA(small hairpin RNA, shRNA)，可以特異的抑制目標基因表達。本實驗通過構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-UL54-shRNA、pGPU6/GFP/Neo-UL29-shRNA重組表達質(zhì)粒，對HSV-2的UL54、UL29同時進行干擾，分析采用雙基因干擾方式對HSV-2病毒復(fù)制的影響，探討沉默UL54和UL29基因在抑制HSV-2過程中可能的協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料 人胚腎293細胞(HEK293)和主要試劑由校區(qū)分子生物學研究室提供，TRIzol、SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit購自中國大連寶生物工程有限公司， Lipofectamine2000購自Invitrogen公司， ICP27、ICP8單克隆抗體購自Santa cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 利用shRNA在線設(shè)計軟件、Blast檢索和RNA structure 5.0軟件篩選UL54和UL29基因的干擾位點 UL54基因的干擾位點：1081-1101，序列GCGTGGTGCAAGATGTGCATT；UL29干擾位點：1461-1481，序列GCACCGGTTGGAATTGATTGC。同時設(shè)陰性對照(Negative control，NC)：序列 GTATGACAACAGCCTCAAG，序列由上海吉瑪制藥技術(shù)技術(shù)有限公司化學合成。使用T4 DNA連接酶將退火后的寡核苷酸雙鏈插入到被BamH I 和Bbs I雙酶切的原始載體pGPU6/GFP/Neo中。對構(gòu)建的表達質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-UL54、pGPU6/GFP/Neo-UL29進行雙酶切鑒定，確定質(zhì)粒構(gòu)建正確。

實驗分為對照組和干擾組。對照組包括空白對照組(pGPU6/GFP/Neo空載體)、陰性對照組(shRNA NC)和內(nèi)參對照組(shRNAGAPDH)，干擾組包括UL54 shRNA、UL29 shRNA單基因干擾組和UL54 shRNA+UL29 shRNA雙基因干擾組。

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，利用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamin2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293細胞。取HEK293細胞接種于24孔板(4～5×104個/孔)，加入100μL質(zhì)粒/lipofectamin2000復(fù)合物，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。棄細胞培養(yǎng)液后，加100μL TCID50HSV-2病毒懸液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后收集細胞上清液，終點滴定法測定細胞上清液中病毒感染滴度，MTT法檢測細胞的存活率(每組設(shè)3個復(fù)孔)。

1.2.2 病毒感染48h后提取細胞總RNA，熒光定量PCR檢測目的基因mRNA的表達 PCR引物設(shè)計序列如下：GAPDH： F-5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，R-5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'；UL54：F-5'-CCAGGACCCTATCATCGGAACG-3'，R-5'-AGTATTTCAATGAGACCCGCCAT-3'；UL29：F-5'- GCCAGGAGATCGACGTGTITTCG-3，R-5'- CGCGCTGTTCATCGTTCCGAAG-3'。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min， 95℃變性20 s、62℃退火30 s、70℃延伸30 s， 40個循環(huán)，72℃再延伸10min。以管家基因GAPDH作為內(nèi)參標準， 2-△△Ct計算mRNA表達量。

1.2.3 Western-blot檢測UL29、UL54蛋白表達水平 提取細胞總蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、半干式電轉(zhuǎn)至PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉，加入一抗，二抗，化學熒光法(ECL)顯色，曝光。以管家基因GADPH為內(nèi)參蛋白表達標準，用Quantity One定量分析軟件分析對Western blot圖譜進行分析。

2 結(jié)果

2.1 子代病毒滴度和細胞存活率 細胞接種HSV-2 48h后，終點滴定法測定的上清子代病毒滴度用TCID50表示。接種病毒48h后，MTT法檢測細胞的存活率，細胞存活率(%)=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%(見表1)。

表1轉(zhuǎn)染后各組的病毒滴度和細胞存活率

組別病毒滴度 (IFU/100μL) 細胞存活率 (%) 空白對照10-6.7±0.530.52±4.28陰性對照10-6.3±0.233.54±3.68▲UL54 shRNA10-3.0±0.1*80.26±4.69*UL29 shRNA10-3.2±0.2*76.49±4.33*UL54shRNA+UL29 shRNA10-2.9±0.1 *#88.64±3.42*#

▲與空白對照組相比P>0.05；*與空白對照組相比P<0.01；#與單基因干擾組相比P<0.01。

由表1可以看出，陰性對照組與空白對照組相比病毒滴度、細胞存活率沒有顯著性改變(P>0.05)；單基因干擾組和雙基因干擾組與空白對照組相比，病毒滴度都有不同程度減低，而細胞存活率明顯增高，差異性顯著(P<0.01)。雙基因干擾組(UL54shRNA + UL29shRNA)與各單基因干擾組相比，病毒滴度下降、細胞存活率升高(P<0.01)。

2.2 表達載體對UL54 、UL29 基因表達的抑制效果 接種HSV-2 48h后，采用熒光定量PCR和Western blot檢測目的基因的表達。用Comparative Delta-delta相對定量法，以空白組為對照計算干擾組mRNA的表達抑制率。各干擾組對病毒目的基因mRNA的抑制率和蛋白相對表達量的結(jié)果(見表2)，Western blotting結(jié)果(見圖1)。

A：a:UL54shRNA1081+UL29shRNA1461；b:UL54sh RNA1081;c:Nrgsitive contyol；B：a：Nrgsitive contyol;b:UL29shRNA1461;c:UL54shRNA1081+UL29shRNA1461。圖1 Western-blot檢測ICP27和ICP8蛋白的表達結(jié)果

從表2可以看出：接種病毒48h后，與單基因干擾組比較，UL54 shRNA+UL29 shRNA雙基因干擾組，對UL54基因mRNA的抑制率和對UL29基因mRNA的抑制率都明顯升高(P<0.01)，而蛋白表達量也明顯減少(P<0.01)。

表2轉(zhuǎn)染后各組的病毒mRNA和蛋白表達抑制率

組別mRNA 抑制率(%) UL54UL29蛋白質(zhì)表達率(%)ICP27ICP8 陰性對照6.325.3989.6585.31UL54 shRNA69.61*-61.27*-UL29 shRNA-66.08*-59.79*UL54shRNA+UL29 shRNA82.56*#74.63*#41.83*#36.58*#

*與陰性對照組相比P<0.01；#與單基因干擾組相比P<0.01。

3 討論

RNA干擾(RNAi)作為一種高效、特異的基因表達阻斷技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于腫瘤和病毒的研究。通過構(gòu)建表達shRNA的重組質(zhì)粒雖然在細胞水平上可以對HSV-2的ICP4、UL27等基因產(chǎn)生一定的沉默作用[7-8]，但尚未達到人們利用RNAi來抑制HSV-2復(fù)制的預(yù)期效果?？赡艿脑虬ǎ孩賀NAi是通過小干擾RNA (small interference RNA ,siRNA)介導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC) 選擇性地降解靶mRNA，由于在細胞內(nèi)RISCs與siRNA的結(jié)合具有一定的飽和性，因此不可能通過增加siRNA的方式來增加mRNA的降解程度，相反過多的siRNA還有可能抑制RISCs活性[9]；②HSV-2感染以及復(fù)制涉及到多種基因的參與，單基因的干擾可能由于基因的變異或敏感性的差異不能取得良好效果。

因此，我們設(shè)想將病毒的2個或者多個基因作為RNAi的分子靶點。根據(jù)我們前期實驗中對UL54基因(數(shù)據(jù)未發(fā)表)和UL29基因[10]干擾位點的篩查，分別構(gòu)建了UL54shRNA和UL29 shRNA表達質(zhì)粒，采用同時干擾UL54和UL29兩個基因的方式，探討其對HSV-2復(fù)制的抑制作用。其中在mRNA水平上的單基因干擾組中UL54 shRNA對UL54基因mRNA的抑制率為69.61%，UL29 shRNA對UL29基因mRNA抑制率為66.08%， UL54 shRNA+UL29 shRNA雙基因干擾組對UL54mRNA表

達的抑制率約為82.56%，UL29mRNA表達抑制率約為74.63%，顯示雙基因干擾在基因沉默上優(yōu)于單基因干擾。通過Western blot得到的ICP27和ICP8表達數(shù)據(jù)也驗證了這種雙基因干擾方式的效果。此外，從子代的病毒滴度的變化和細胞的存活率等上也表明UL54 shRNA+UL29 shRNA雙基因干擾組的子代病毒滴度最低，細胞的存活率也更高，說明其能更好的抑制HSV-2的復(fù)制。

HSV-2基因組表達具有時序性，基因表達之間會產(chǎn)生相互的影響和作用。UL29基因表達產(chǎn)物ICP8在病毒合成中扮演關(guān)鍵作用，能夠控制其它基因表達并參與轉(zhuǎn)錄前位點和轉(zhuǎn)錄區(qū)的形成。立即早期基因UL54的表達產(chǎn)物ICP27除了參與調(diào)節(jié)HSV-2病毒和宿主細胞mRNA的合成與成熟以外，還能與其它立即早期基因表達產(chǎn)物一起調(diào)控早期基因和晚期基因的表達，如抑制其它立即早期基因和早期基因的表達。因此，同時干擾阻斷UL54、UL29基因表達，可能會在阻斷二者基因表達過程中產(chǎn)生相互的協(xié)調(diào)作用，能夠更好地抑制病毒基因組的復(fù)制。對阻止HSV-2病毒感染宿主細胞和抑制DNA合成復(fù)制有更好的效果。本實驗結(jié)果表明這種對病毒不同基因的聯(lián)合干擾效果優(yōu)于對單個基因的干擾效果，提示采用多基因聯(lián)合干擾可能在今后的臨床研究中具有潛在的價值。

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