張 鶴，周 陽，楊月琴，金 麗

(1.武漢體育學(xué)院 健康科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 4300792；2.解放軍150醫(yī)院 全軍軍事訓(xùn)練醫(yī)學(xué)研究所，河南 洛陽 4710313)

運(yùn)動性低血紅蛋白被認(rèn)為是運(yùn)動員在長期運(yùn)動性疲勞過程中出現(xiàn)的一種運(yùn)動性損傷。Weight LM等對長跑和芭蕾舞運(yùn)動員的研究表明11.7%的長跑運(yùn)動員和20%的芭蕾舞運(yùn)動員的Hb濃度低于正常水平[1]，運(yùn)動性低血紅蛋白的發(fā)生嚴(yán)重影響運(yùn)動員成績與潛能的發(fā)揮。三七作為我國傳統(tǒng)中藥材，其來源豐富，相關(guān)藥理學(xué)證明三七總皂苷(PNS)在耐缺氧、抗衰老、提高機(jī)體免疫力等方面的藥理作用顯著，有研究表明三七皂苷不僅能夠促進(jìn)紅系造血，而且在防止機(jī)體氧化應(yīng)激方面有良好的效果[3]。本文將從機(jī)體氧化環(huán)境的影響來綜合分析運(yùn)動性低血色素的成因，并利用三七皂苷來防治運(yùn)動性低血紅素并評價其對各個過程的影響，為防治運(yùn)動性低血紅素提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

選取雄性4周齡的SD大鼠24只，體重如表1，由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物級別：SPF級。隨機(jī)分為3組：對照組(8只)、遞增負(fù)荷力竭跑臺運(yùn)動組(簡稱運(yùn)動組，8只)、遞增負(fù)荷力竭跑臺運(yùn)動灌藥組(簡稱灌藥組，8只)。動物飼料為國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物混合飼料，由湖北省疾病控制中心動物實(shí)驗(yàn)中心提供。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度23±2℃；分籠飼養(yǎng)，每籠4只，自由飲食，自然晝夜節(jié)律變化光照。具體情況見表1。

表1

組別 n體重(g) 對照組 8 154.88±28.34 運(yùn)動組 8 169.14±37.84 灌藥組 8 172.36±27.91

1.2 實(shí)驗(yàn)動物運(yùn)動方案

所有大鼠先進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，運(yùn)動組大鼠進(jìn)行遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練10周，動物跑臺坡度為0°，跑速為30 m/min，第一次訓(xùn)練時間為1min，以后每次遞增2min，每周訓(xùn)練6天，前2周每天進(jìn)行一次訓(xùn)練，其余時間為每天早晚各1次，周一休息。灌藥組訓(xùn)練計劃與運(yùn)動組一樣，于第六周開始每天灌藥一次，藥量為11 mg/kgw。對照組不運(yùn)動，自由飼養(yǎng)10周。為了排除灌藥行為對SD大鼠的影響，運(yùn)動組與對照組從第六周起都灌相對劑量的生理鹽水。訓(xùn)練過程中判斷大鼠力竭的標(biāo)準(zhǔn)為：連續(xù)施加機(jī)械刺激大鼠不能繼續(xù)跑動且下跑臺后腹部觸地嚴(yán)重呈“甲魚狀”，則可以允許其休息2-5min。

1.3 樣本采集

訓(xùn)練開始前和訓(xùn)練結(jié)束后對各組大鼠進(jìn)行斷尾采血用于常規(guī)血液指標(biāo)的測定。訓(xùn)練結(jié)束后用不抗凝負(fù)壓管心尖采血取大鼠心血4-5 ml，靜置1 h，之后用離心機(jī)4 000 rpm離心10 min，得到的血清轉(zhuǎn)移至EP管中。

1.4 指標(biāo)的測定

全血指標(biāo)的測定：用sysmexF-820全血細(xì)胞分析儀測定斷尾血樣的血紅蛋白(Hb)和紅細(xì)胞數(shù)目(RBC)等指標(biāo)。

血清樣本中SOD、MDA的測定：用黃嘌呤氧化酶法測定SOD的活力(波長于550nm處，1cm光徑比色杯)，用硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA濃度(波長于532nm處，1cm光徑)；均采用南京建成生物工程公司試劑盒測定，并按試劑盒的操作程序進(jìn)行測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間顯著性差異比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重、體征和行為的變化

運(yùn)動組大鼠經(jīng)過10周遞增負(fù)荷力竭跑臺運(yùn)動后，其體重與對照組相比低11.31%，有顯著性差異(P<0.05)。該組大鼠的皮毛明顯失去光澤，脫毛現(xiàn)象嚴(yán)重，毛發(fā)脫落成稀疏狀，眼神變得黯淡無光，進(jìn)食明顯減少。而后兩周多數(shù)大鼠訓(xùn)練過程中極易出現(xiàn)嚴(yán)重疲憊的特征：腹部觸地或嚴(yán)重地呈“甲魚狀”，呼吸急促，運(yùn)動協(xié)調(diào)能力明顯下降，逃避反映減少或消失，探索行為減少或消失，持續(xù)運(yùn)動時間減少。灌藥組大鼠體重雖然較對照組沒有顯著性差異，但是較運(yùn)動組高6.2%。

表2 10周遞增負(fù)荷運(yùn)動對各組大鼠體重的影響

組別 n體重(g) 對照組 8 345±35.23 運(yùn)動組 8 306±22.24** 灌藥組 8 325±38.98

注：與對照組相比，**P<0.05。

2.2 十周遞增負(fù)荷力竭跑臺運(yùn)動后各組大鼠血液指標(biāo)

運(yùn)動組Hb較對照組Hb低24.2%，但無統(tǒng)計學(xué)意義；灌藥組Hb較運(yùn)動組提高了9.5%，但無顯著性差異。運(yùn)動組RBC較對照組RBC低17.3%，但無統(tǒng)計學(xué)意義；灌藥組RBC較運(yùn)動組提高了0.8%，但無顯著性差異。

表3 10周遞增負(fù)荷運(yùn)動對血液指標(biāo)的影響

組別 nHb(g/dL) RBC(106/μL) 對照組 8 16.55±0.44 9.02±0.71 運(yùn)動組 8 12.53±1.74 7.46±0.73 灌藥組 8 13.72±0.80 7.52±0.92

2.3 十周遞增負(fù)荷跑臺運(yùn)動后各組大鼠SOD、MDA的結(jié)果

十周遞增負(fù)荷運(yùn)動后大鼠運(yùn)動組SOD較對照組低5.6%，但無統(tǒng)計學(xué)意義，灌藥組SOD較運(yùn)動組提高了25.3%，但無統(tǒng)計學(xué)意義；運(yùn)動組MDA較對照組顯著性升高(P<0.05)，灌藥組MDA較運(yùn)動組顯著性降低(P<0.05)。

表4 10周遞增負(fù)荷運(yùn)動對SOD、MDA的影響

組別 n SOD(U/ml) MDA(nmol/ml) 對照組 8 30.74±18.64 3.24±0.20 運(yùn)動組 8 29.02±19.70 5.16±0.89* 灌藥組 8 36.37±15.93 3.80±2.02**

注：與對照組相比，*P<0.01，與運(yùn)動組相比，**P<0.05。

3 分析與討論

3.1 三七皂苷對運(yùn)動性低血色素大鼠紅細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的影響

研究發(fā)現(xiàn)在大強(qiáng)度大負(fù)荷的訓(xùn)練期間，運(yùn)動員血紅蛋白濃度容易發(fā)生10%以上的降低，形成了一種相對的貧血狀態(tài)，其稱之為運(yùn)動性低血紅蛋白[4, 5]。本研究結(jié)果顯示經(jīng)過遞增負(fù)荷跑臺運(yùn)動后Hb、RBC較對照組雖沒顯著性下降，但是Hb較對照組下降了24.2%>10%，符合了運(yùn)動性低血紅蛋白的條件。而灌藥組Hb、RBC雖相對于運(yùn)動組沒有顯著性差異，但是也是有相對改善，可能與藥量不足有關(guān)。趙宗翼等對云南競走隊的6名高水平運(yùn)動員，進(jìn)行常規(guī)的系統(tǒng)訓(xùn)練，每日早晚服用三七維康膠囊，1粒/次(330mg/粒)，每人每日劑量約600mg左右。試驗(yàn)12周，并測4次清晨空腹靜脈血,進(jìn)行血細(xì)胞分析。結(jié)果顯示紅細(xì)胞、血球壓積、紅細(xì)胞平均體積和紅細(xì)胞平均體積分布寬度指標(biāo)經(jīng)過6周服藥后均有所提高，且在12周的測試中4項均具差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究認(rèn)為三七維康膠囊可以提高競走運(yùn)動員紅細(xì)胞及衍生指標(biāo)、血紅蛋白指標(biāo)、白細(xì)胞指標(biāo)水平，一定程度上可以提高其運(yùn)氧能力和抗疲勞功效[6]。由此可見三七皂苷對各種原因引起的血色素降低，均有一定的療效，但是根據(jù)引起血色素降低的原因不同，使用劑量和方法也有所差別。

3.2 三七皂苷對運(yùn)動性低血色素大鼠氧化應(yīng)激的影響

運(yùn)動中或運(yùn)動后機(jī)體的耗氧量增加，或者特定通路的激活，是活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的主要來源[7～9]。有大量研究表明，不適應(yīng)的運(yùn)動和劇烈運(yùn)動可引起氧自由基與抗氧化系統(tǒng)之間的失衡，偏向ROS的生成[10,11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)10周遞增負(fù)荷運(yùn)動后運(yùn)動組大鼠SOD較對照組低5.6%，MDA較對照組顯著性升高，說明了機(jī)體組織細(xì)胞內(nèi)的氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，ROS大量產(chǎn)生并對機(jī)體產(chǎn)生一系列不利的影響。一方面機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的ROS通過破壞成熟紅細(xì)胞的細(xì)胞膜使其發(fā)生裂解，導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞加劇。另一方面又通過多種途徑導(dǎo)致紅細(xì)胞生成減少。首先研究表明過度訓(xùn)練產(chǎn)生的過量ROS引起線粒體上的通透性轉(zhuǎn)換孔打開[12]，這時低分子量的分子(<1.5kDa)順著濃度差進(jìn)入到線粒體內(nèi)部，導(dǎo)致線粒體腫脹和外膜破裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此可以得知ROS可通過激活線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑導(dǎo)致紅系造血過程中的前體細(xì)胞死亡，造成紅細(xì)胞生成減少。另一方面有研究表明ROS能夠激活血紅素抑制激酶(HRI)[13]，HRI能夠使真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起始因子2的ɑ亞基(elF2ɑ)磷酸化[14, 15]，從而限制血紅蛋白的合成。

通過elF2ɑ磷酸化阻礙血紅蛋白翻譯起始階段的分子學(xué)機(jī)制已被廣泛的研究[17,18]，elF2是一種三聚體蛋白，在其γ亞基上有GTP/GDP結(jié)合位點(diǎn)。被激活的elF2-GTP與起始甲硫氨?；鵷RNA和40S核糖體亞基結(jié)合形成43S前起始復(fù)合物。緊接著其又與60S核糖體亞基結(jié)合，綁定在elF2上的GTP水解為GDP，釋放的能量用于80S起始核糖體的合成。為了回收elF2在用于下一個起始過程，就需要將其綁定結(jié)合的GDP轉(zhuǎn)化為GTP。這個過程需要另一個起始因子elF2B，其在細(xì)胞內(nèi)的量十分有限。當(dāng)elF2ɑ亞基上51位上的絲氨酸被HIR磷酸化后，它將和elF2B緊密結(jié)合并使其失活。當(dāng)活化的elF2B發(fā)生缺乏時，elF-2將會維持在失活的GDP狀態(tài)并阻礙血紅蛋白的合成。因此ROS通過對HRI的激活導(dǎo)致elF2ɑ的磷酸化來抑制血紅蛋白的合成進(jìn)而阻礙紅系分化增殖過程。因此總的來說，由于過度訓(xùn)練導(dǎo)致ROS的增加不僅可以導(dǎo)致紅細(xì)胞的破壞加劇而且使紅系造血過程受到抑制，可能是造成運(yùn)動性低血紅蛋白的主要因素。

人參皂苷Re作為PNS的單體之一，潘華山等人通過研究表明人參皂苷Re能降低運(yùn)動性疲勞模型大鼠血清、肝和骨骼肌MDA含量,提高紅細(xì)胞、肝和骨骼肌SOD活性,從而達(dá)到抗疲勞的作用[19]。三七單體皂苷G-Rb1可以增加人紅細(xì)胞膜蛋白α螺旋的比例，即增加膜蛋白的有序性，從而改善紅細(xì)胞膜功能[20]。在本次實(shí)驗(yàn)中，灌藥組SOD較運(yùn)動組提高了25.3%，灌藥組MDA較運(yùn)動組顯著性降低，表明三七皂苷能夠明顯改善機(jī)體的氧化環(huán)境，防止紅細(xì)胞膜的裂解從而保護(hù)紅細(xì)胞。另外，三七皂苷也可能通過減少機(jī)體的ROS水平進(jìn)而抑制血紅素抑制激酶(HRI)的產(chǎn)生，從而使減少elF2ɑ的磷酸化從而促進(jìn)血紅蛋白的合成，進(jìn)而促進(jìn)紅系造血。

4 小結(jié)

三七皂苷具有降低體內(nèi)氧自由基水平，改善機(jī)體氧化環(huán)境，降低低氧機(jī)制的閾值，增強(qiáng)機(jī)體的抗低氧能力，增強(qiáng)機(jī)體的適應(yīng)性，從而改善大鼠運(yùn)動性低血色素癥狀。

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