李曉娜等

摘 要 從海南省10個縣市的15個不同地點采集橡膠樹RRIM600品系的葉、枝、果、根等組織進行分離培養(yǎng)，共獲得內(nèi)生真菌507株，415株能夠產(chǎn)生孢子，根據(jù)形態(tài)特征鑒定為18個屬，23個種，其中絲孢綱真菌9個屬，10個種；腔孢綱真菌6個屬，9個種；子囊菌門真菌3個屬，4個種。初步研究表明：在所研究不同地區(qū)的橡膠樹中，穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節(jié)孢（Nodulisporium sylviform）、刺盤孢（Colletotrichum sp.）均有分布。不同地區(qū)橡膠樹內(nèi)生真菌定殖率為17%～100%，分離率為0.42～0.97。不同地點橡膠樹中內(nèi)生真菌群落組成的相似性比較結(jié)果表明，地理分布對橡膠樹中內(nèi)生真菌組成具有一定的影響。

關(guān)鍵詞 內(nèi)生真菌 ；橡膠樹 ；不同地點 ；多樣性

分類號 S794.1 ；S646

Abstract A total of 507 endophytic fungi strains were obtained from leaves， branches， fruits， and roots of rubber tree clone RRIM600 from 15 sample places in 10 cities and counties in Hainan Province. Among them， 415 strains can produce spores. According to their morphological characteristics， 415 strains were identified and classified into 18 genera， 23 species. 9 genera， 10 species belonged to Hyphomycetes， 6 genera， 9 species belonged to Coelomycetes， and 3 genera， 4 species belonged to Ascomycetes. Preliminary studies indicate that Nigrospora oryzae， Nodulisporium sylviform and Colletotrichum sp. were distributed in rubber trees from different sample places. The endophytic fungal colonization rates in the rubber tree from 15 different locations were ranged from 17% to 100%， and the isolation rates from 0.42 to 0.97， respectively. Similarity comparison of endophytic fungi community compositions in rubber tree at different locations suggested geographical distribution has a certain impact on the community composition of endophytic fungi in rubber tree.

Keywords endophytic fungi ； Hevea brasiliensis ； diversity

植物內(nèi)生真菌（endophytic fungi）是自然界微生物環(huán)境的重要組成部分，與植物之間存在密切的互利共生關(guān)系，對植物的生理代謝調(diào)控和生長發(fā)育有較大的影響，某些植物內(nèi)生真菌的存在還使植物避免或減輕病原真菌的侵染危害，增強宿主植物對病蟲害的抵抗能力[1]。本研究以海南RRIM600品系橡膠樹的葉、枝、果、根等組織為材料，通過研究海南省不同地區(qū)同一品系橡膠樹內(nèi)生真菌的多樣性、群落組成及生態(tài)分布規(guī)律，國內(nèi)首次研究橡膠樹中內(nèi)生真菌對宿主和組織的偏好性，為進一步篩選拮抗菌打下良好的基礎(chǔ)。

1.2.1 消毒

首先將采集的枝條、根、果分別切成5 mm長的小段，葉片打成直徑5 mm的圓片，接著按照以下步驟進行消毒：75%乙醇浸泡1 min、4%活性次氯酸鈉消毒5 min、75%乙醇中浸30 s、滅菌水洗3次[2]。

1.2.2 分離方法的有效性測定

為確保組織塊長出的真菌為橡膠樹的內(nèi)生真菌，組織表面消毒后用第1次滅菌水洗和最后一次滅菌水洗后的水樣在PAD培養(yǎng)基上畫線，每個處理作3個重復，培養(yǎng)3～5 d后觀察，不長任何細菌或真菌等微生物，證明所用的表面消毒方法有效。

1.2.3 內(nèi)生真菌的鑒定

內(nèi)生真菌的形態(tài)鑒定根據(jù)其菌落大小、顏色、表面特征、質(zhì)地和生長速度等，結(jié)合附著胞、菌絲、子實體、孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等個體的形態(tài)特征，參閱《植物病原真菌學》[3]和《中國的真菌》[4]等文獻進行鑒定。2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌定殖率和分離率

在海南省除儋州和烏石外，15個不同地區(qū)每個區(qū)域各采集3株健康植株的葉、枝條、根和果的660個表面消毒的組織塊中，分離獲得507個內(nèi)生真菌菌株。從宿主水平看，不同地區(qū)的橡膠樹中內(nèi)生真菌定殖率在39.6%～75%，屯昌橡膠樹中內(nèi)生真菌定殖率最高為75%，長征農(nóng)場橡膠樹內(nèi)生真菌定殖率最低為39.6%；不同地區(qū)的橡膠樹中內(nèi)生真菌分離率在0.52～1.11，白沙膠樹中內(nèi)生真菌分離率最高達到1.11，昌江橡膠樹內(nèi)生真菌分離率最低為0.52。從組織水平看，不同地區(qū)的橡膠樹內(nèi)生真菌定殖率以屯昌地區(qū)的橡膠樹枝條最高（100%）；不同地區(qū)的橡膠樹內(nèi)生真菌分離率最高的是白沙縣枝條（1.58），其他地點詳情見表1。endprint

2.2 內(nèi)生真菌的組成

不同地區(qū)采集的橡膠樹樣品中內(nèi)生真菌種類組成不同，共分離得到507株內(nèi)生真菌中，有415株可產(chǎn)生孢子，通過形態(tài)特征鑒定共計18個屬，23個種，其中絲孢綱9個屬，10個種，腔孢綱6個屬，9個種，子囊菌門3個屬，4個種；另有92株內(nèi)生真菌經(jīng)組織誘導后仍然不能產(chǎn)孢（18.15%），歸為不產(chǎn)孢類群（Mycelia Sterilia）。研究結(jié)果表明：從不同地區(qū)采集的橡膠樹組織中分離獲得內(nèi)生真菌種類和數(shù)量均不相同。其中穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節(jié)孢（Nodulisporium sylviform）、刺盤孢（Colletotrichum sp.）在不同地區(qū)橡膠樹中均有分布。

3 討論

根據(jù)相對頻率，在所研究不同地區(qū)的橡膠樹中穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節(jié)孢（Nodulisporium sylviform）、刺盤孢（Colletotrichum sp.）均有分布。刺盤孢（Colletotrichum sp.）是樂中、文昌地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種，梨葉點霉（Phyllosticta pirina）是瓊海、屯昌、三更羅、東方大田地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種，穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）是五指山地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種，擬莖點霉（Phomopsis rich）是大嶺農(nóng)場、東和農(nóng)場、昌江、文昌、樂中地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種，Xylaria sp.是白沙地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種。

本研究鑒定出不同地點同一品系橡膠樹內(nèi)生真菌共計18個屬，23個種，分離到的屬和其中的某些種曾在其它植物內(nèi)生真菌研究中有報道，如從小桐子（Amomum siamense）上分離到黑痣菌屬（Phyllachora）[7]；在熱帶玉米和黃花夾竹桃上分離到黑孢子菌屬（Nigrospora）的種[8]；在東北紅豆杉上分離到炭角菌屬（Xylaria）[9]；在亮毛杜鵑上分離到青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）[10]；在柬埔寨龍血樹上分離到枝孢菌屬（Cladosporium）和黑酵母菌屬（Aureobasidium）[11]；在東北紅豆杉上分離到樹狀多節(jié)孢菌（Nodulisporium sylviforme）[12]；在銀杏上分離到，刺盤孢屬（Colletotrichum）[13]；在楓樹（Bpubescens）上分離到擬莖點霉屬（Phomopsis）[14]；在石莼（Ulva sp.）上分離到殼二孢屬（Ascochyta）[15]。從橡膠樹上分離到的這些菌株可以作為開發(fā)利用的研究材料。

研究結(jié)果表明，不同地區(qū)橡膠樹內(nèi)生真菌的分布具有一定組織偏好性，這種偏好性產(chǎn)生的原因可能是不同地區(qū)的光照強度、降雨量、海拔高度、土壤結(jié)構(gòu)等自然條件不同，不同真菌對光照、水分等自然條件的需求也不同，從而影響了內(nèi)生真菌的侵染、生長和分布。

海南省橡膠樹種植面積廣泛，全面調(diào)查橡膠樹內(nèi)生真菌，進行海南橡膠樹內(nèi)生真菌多樣性研究，收集大量的橡膠樹內(nèi)生真菌資源，將為進一步篩選拮抗菌，開發(fā)生防菌劑奠定良好的基礎(chǔ)。

參考文獻

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[14] Barengo N， Sieber T N， Holdenrieder O. Diversity of endophytic mycobiota in leaves and twigs of pubescent birch （Betula pubescens）[J]. Sydowia， 2000， 52： 305-320.

[15] Osterhage C， Kaminsky R，Konig G M. Ascasalipyrrolidinone A， an antirnicrobial alkaloid， from the obligate marine fungus Ascochhyta salicorniae[J]. J. Org. Chem， 2000， 65（20）： 6 412-6 417.endprint

2.2 內(nèi)生真菌的組成

不同地區(qū)采集的橡膠樹樣品中內(nèi)生真菌種類組成不同，共分離得到507株內(nèi)生真菌中，有415株可產(chǎn)生孢子，通過形態(tài)特征鑒定共計18個屬，23個種，其中絲孢綱9個屬，10個種，腔孢綱6個屬，9個種，子囊菌門3個屬，4個種；另有92株內(nèi)生真菌經(jīng)組織誘導后仍然不能產(chǎn)孢（18.15%），歸為不產(chǎn)孢類群（Mycelia Sterilia）。研究結(jié)果表明：從不同地區(qū)采集的橡膠樹組織中分離獲得內(nèi)生真菌種類和數(shù)量均不相同。其中穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節(jié)孢（Nodulisporium sylviform）、刺盤孢（Colletotrichum sp.）在不同地區(qū)橡膠樹中均有分布。

3 討論

根據(jù)相對頻率，在所研究不同地區(qū)的橡膠樹中穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節(jié)孢（Nodulisporium sylviform）、刺盤孢（Colletotrichum sp.）均有分布。刺盤孢（Colletotrichum sp.）是樂中、文昌地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種，梨葉點霉（Phyllosticta pirina）是瓊海、屯昌、三更羅、東方大田地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種，穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）是五指山地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種，擬莖點霉（Phomopsis rich）是大嶺農(nóng)場、東和農(nóng)場、昌江、文昌、樂中地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種，Xylaria sp.是白沙地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種。

本研究鑒定出不同地點同一品系橡膠樹內(nèi)生真菌共計18個屬，23個種，分離到的屬和其中的某些種曾在其它植物內(nèi)生真菌研究中有報道，如從小桐子（Amomum siamense）上分離到黑痣菌屬（Phyllachora）[7]；在熱帶玉米和黃花夾竹桃上分離到黑孢子菌屬（Nigrospora）的種[8]；在東北紅豆杉上分離到炭角菌屬（Xylaria）[9]；在亮毛杜鵑上分離到青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）[10]；在柬埔寨龍血樹上分離到枝孢菌屬（Cladosporium）和黑酵母菌屬（Aureobasidium）[11]；在東北紅豆杉上分離到樹狀多節(jié)孢菌（Nodulisporium sylviforme）[12]；在銀杏上分離到，刺盤孢屬（Colletotrichum）[13]；在楓樹（Bpubescens）上分離到擬莖點霉屬（Phomopsis）[14]；在石莼（Ulva sp.）上分離到殼二孢屬（Ascochyta）[15]。從橡膠樹上分離到的這些菌株可以作為開發(fā)利用的研究材料。

研究結(jié)果表明，不同地區(qū)橡膠樹內(nèi)生真菌的分布具有一定組織偏好性，這種偏好性產(chǎn)生的原因可能是不同地區(qū)的光照強度、降雨量、海拔高度、土壤結(jié)構(gòu)等自然條件不同，不同真菌對光照、水分等自然條件的需求也不同，從而影響了內(nèi)生真菌的侵染、生長和分布。

海南省橡膠樹種植面積廣泛，全面調(diào)查橡膠樹內(nèi)生真菌，進行海南橡膠樹內(nèi)生真菌多樣性研究，收集大量的橡膠樹內(nèi)生真菌資源，將為進一步篩選拮抗菌，開發(fā)生防菌劑奠定良好的基礎(chǔ)。

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[15] Osterhage C， Kaminsky R，Konig G M. Ascasalipyrrolidinone A， an antirnicrobial alkaloid， from the obligate marine fungus Ascochhyta salicorniae[J]. J. Org. Chem， 2000， 65（20）： 6 412-6 417.endprint

2.2 內(nèi)生真菌的組成

不同地區(qū)采集的橡膠樹樣品中內(nèi)生真菌種類組成不同，共分離得到507株內(nèi)生真菌中，有415株可產(chǎn)生孢子，通過形態(tài)特征鑒定共計18個屬，23個種，其中絲孢綱9個屬，10個種，腔孢綱6個屬，9個種，子囊菌門3個屬，4個種；另有92株內(nèi)生真菌經(jīng)組織誘導后仍然不能產(chǎn)孢（18.15%），歸為不產(chǎn)孢類群（Mycelia Sterilia）。研究結(jié)果表明：從不同地區(qū)采集的橡膠樹組織中分離獲得內(nèi)生真菌種類和數(shù)量均不相同。其中穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節(jié)孢（Nodulisporium sylviform）、刺盤孢（Colletotrichum sp.）在不同地區(qū)橡膠樹中均有分布。

3 討論

根據(jù)相對頻率，在所研究不同地區(qū)的橡膠樹中穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節(jié)孢（Nodulisporium sylviform）、刺盤孢（Colletotrichum sp.）均有分布。刺盤孢（Colletotrichum sp.）是樂中、文昌地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種，梨葉點霉（Phyllosticta pirina）是瓊海、屯昌、三更羅、東方大田地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種，穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）是五指山地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種，擬莖點霉（Phomopsis rich）是大嶺農(nóng)場、東和農(nóng)場、昌江、文昌、樂中地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種，Xylaria sp.是白沙地區(qū)采集橡膠樹中的優(yōu)勢種。

本研究鑒定出不同地點同一品系橡膠樹內(nèi)生真菌共計18個屬，23個種，分離到的屬和其中的某些種曾在其它植物內(nèi)生真菌研究中有報道，如從小桐子（Amomum siamense）上分離到黑痣菌屬（Phyllachora）[7]；在熱帶玉米和黃花夾竹桃上分離到黑孢子菌屬（Nigrospora）的種[8]；在東北紅豆杉上分離到炭角菌屬（Xylaria）[9]；在亮毛杜鵑上分離到青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）[10]；在柬埔寨龍血樹上分離到枝孢菌屬（Cladosporium）和黑酵母菌屬（Aureobasidium）[11]；在東北紅豆杉上分離到樹狀多節(jié)孢菌（Nodulisporium sylviforme）[12]；在銀杏上分離到，刺盤孢屬（Colletotrichum）[13]；在楓樹（Bpubescens）上分離到擬莖點霉屬（Phomopsis）[14]；在石莼（Ulva sp.）上分離到殼二孢屬（Ascochyta）[15]。從橡膠樹上分離到的這些菌株可以作為開發(fā)利用的研究材料。

研究結(jié)果表明，不同地區(qū)橡膠樹內(nèi)生真菌的分布具有一定組織偏好性，這種偏好性產(chǎn)生的原因可能是不同地區(qū)的光照強度、降雨量、海拔高度、土壤結(jié)構(gòu)等自然條件不同，不同真菌對光照、水分等自然條件的需求也不同，從而影響了內(nèi)生真菌的侵染、生長和分布。

海南省橡膠樹種植面積廣泛，全面調(diào)查橡膠樹內(nèi)生真菌，進行海南橡膠樹內(nèi)生真菌多樣性研究，收集大量的橡膠樹內(nèi)生真菌資源，將為進一步篩選拮抗菌，開發(fā)生防菌劑奠定良好的基礎(chǔ)。

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