陸錚錚+蔣選利

摘要：為篩選出煙草青枯病菌的拮抗細(xì)菌，從貴州省天柱縣、黃平縣及大方縣煙草根圍土壤中共分離出65株細(xì)菌。采用平板噴霧法篩選獲得20株拮抗細(xì)菌，且抑制效果穩(wěn)定，其中有2株拮抗細(xì)菌平均抑菌圈直徑大于20 mm，分別為C3-5（39.98 mm）和C5-3（48.88 mm）。采用16S rDNA序列分析以及形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、染色結(jié)果等方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，C3-5為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），C5-3為球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericu）。

關(guān)鍵詞：煙草青枯?。晦卓辜?xì)菌；生物防治；篩選；鑒定；蠟樣芽孢桿菌；球形賴氨酸芽孢桿菌

中圖分類號(hào)： S435.72文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0099-03

收稿日期：2013-09-22

基金項(xiàng)目：中國(guó)煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目（編號(hào)：200917）；貴州銅仁地區(qū)煙草公司項(xiàng)目[編號(hào)：貴銅煙（2009）10]。

作者簡(jiǎn)介：陸錚錚（1986—），女，碩士，助教，研究方向?yàn)橹参锊『ι锓乐?。E-mail：luzheng_zheng@126.com。

通信作者：蔣選利，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榉肿又参锊±韺W(xué)。E-mail：jxl3237@163.com。青枯病病原菌原名為茄假單胞桿菌（Pseudomonas solanacearum E. F. Smith），1995年更改為茄勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum E. F. Smith）[1]。煙草青枯病是一種典型的維管束細(xì)菌性土傳病害，最顯著的癥狀是枯萎。該病害廣泛分布于熱帶、亞熱帶等50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，在我國(guó)南方普遍存在且危害嚴(yán)重，它具有發(fā)病快、危害重、損失大等特點(diǎn)，且常與黑脛病和空莖病混合發(fā)生[2]，給防治帶來(lái)了較大的困難。目前，對(duì)于煙草青枯病的防治還是以化學(xué)防治為主，近幾年研究者們篩選出了許多對(duì)煙草青枯病有較好抑制效果的藥劑，如30.2%芽敵水劑[3]、72%農(nóng)用硫酸鏈霉素[4]以及1 B°石硫合劑[5]等藥劑。但是化學(xué)農(nóng)藥會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，威脅人畜的健康和安全，且隨著施用年限和濃度的增加，易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性。隨著煙草青枯病防治研究的不斷深入，生物防治已成為防治該病害的研究熱點(diǎn)，尤其是通過(guò)篩選根圍土壤中的拮抗菌與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生存空間的方法，降低病原菌的繁殖率，從而有效控制病害，且對(duì)環(huán)境無(wú)污染，是一種綠色的防治方法。土壤是一切自然環(huán)境中細(xì)菌的總發(fā)源地，在土壤中存在著許多對(duì)人類有益的細(xì)菌，它們具有分解或者合成的作用，是人類的功臣[6]。可以說(shuō)，土壤為篩選拮抗細(xì)菌防治植物病害提供了很多的細(xì)菌資源。且細(xì)菌容易分離、繁殖較快，是生物防治的理想菌種。因此，本研究從貴州省天柱縣社學(xué)鄉(xiāng)等發(fā)青枯病的煙田土壤中篩選出對(duì)青枯病菌具有拮抗作用的細(xì)菌并進(jìn)行鑒定。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株從貴州省麻江縣五寨鄉(xiāng)煙草種植區(qū)中選擇發(fā)煙草青枯病嚴(yán)重的田塊，從中采集病株帶回實(shí)驗(yàn)室，采用平板劃線分離法進(jìn)行分離、純化[7]。鑒定為煙草青枯病病原菌后，用蘸根接種法回接[8]，待發(fā)病后，再分離和純化病原菌，并采用滅菌蒸餾水保存方法保存?zhèn)溆肹9]。

1.1.2土壤樣品從貴州省天柱縣社學(xué)鄉(xiāng)、黃平縣白塘村及大方縣雙山鎮(zhèn)的煙草種植地中選擇發(fā)青枯病的煙田，從中采集健康煙株的根圍土壤，共12份。

1.1.3培養(yǎng)基及試劑

1.1.3.1分離和篩選培養(yǎng)基煙草青枯病病原菌和土壤細(xì)菌的分離以及對(duì)峙培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)基均為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（NA）。

1.1.3.2細(xì)菌鑒定培養(yǎng)基[10]馬鈴薯塊斜面培養(yǎng)基：將馬鈴薯洗凈去皮，切成長(zhǎng)3.5～4.0 cm、寬0.5 cm的楔形薯塊斜面。為防止薯塊干燥，先在試管底部放1團(tuán)吸飽水的棉花，再將薯塊粗的一端向下放入試管中，塞上棉塞，常規(guī)滅菌。為了中和細(xì)菌分解淀粉而產(chǎn)生過(guò)多的酸，可在滅菌前于薯塊斜面上加少量碳酸鈣。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏 3～5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸餾水 1 000 mL，pH 值7.0～7.2。

1.1.3.3細(xì)菌鑒定染色劑革蘭氏染色劑和芽孢染色劑（孔雀綠染色劑）。

1.2方法

1.2.1病原菌分離選取煙草青枯病病株發(fā)病部位的一小塊組織（0.5 cm×0.5 cm）制成臨時(shí)裝片，用顯微鏡觀察細(xì)菌特有的噴菌現(xiàn)象，再選取被檢測(cè)發(fā)病部位周圍的組織，采用平板劃線分離法分離[7]。

1.2.2土壤采集選取種植年限較長(zhǎng)且青枯病發(fā)生較重的煙田，在煙草旺長(zhǎng)期采集健康煙株的根圍土壤（避免雨季采土）。取樣時(shí)先除去地面落葉和垃圾，撥開(kāi)表土約 5 cm 深，剔除石礫和植被殘根等雜物，每份樣土約30 g（同地區(qū)取樣點(diǎn)至少相距100 m），裝入自封袋并做上記號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.3土壤細(xì)菌分離采用稀釋平板法[7]：用1/100天平準(zhǔn)確稱取土樣10 g，放入裝有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中（瓶里放幾粒無(wú)菌玻璃珠），置于搖床振蕩20 min，使微生物細(xì)胞分散后，靜置20～30 s，即成10-1土樣稀釋液。用1 mL移液槍吸取10-1土樣稀釋液1 mL，移入裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，混勻、稀釋，即成10-2稀釋液，再換1支無(wú)菌搶頭吸取10-2 稀釋液1 mL，移入另支裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，再混勻、稀釋，即成10-3 稀釋液。依此類推，就會(huì)得到不同濃度的懸浮液，分離細(xì)菌所需稀釋倍數(shù)為103、104、105倍。

將培養(yǎng)基平板分別標(biāo)上稀釋度及樣品編號(hào)，然后用移液槍吸取各樣品各稀釋度0.1 mL對(duì)號(hào)分散放于平板中，用無(wú)菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻。放置20 min后將平板倒置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。

1.2.4拮抗細(xì)菌篩選方法平板噴霧法[11]：將土壤細(xì)菌接在NA平板中央，于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌體已在培養(yǎng)基上定殖后（約3 d），用無(wú)菌的喉頭噴霧器將濃度為 3億CFU/mL 的煙草青枯菌懸液噴入NA培養(yǎng)基上，靜置 20 min 后，將平板倒扣置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后觀察并測(cè)量抑菌圈的直徑。以NA平板上不接菌只噴青枯菌作對(duì)照。初篩時(shí)做3個(gè)重復(fù)，挑選出效果較好的生防菌進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩時(shí)做5個(gè)重復(fù)。抑菌圈直徑的計(jì)算公式為：抑菌圈直徑=[（長(zhǎng)直徑-生防菌直徑）+（短直徑-生防菌直徑）]/2；平均抑菌圈直徑=重復(fù)的抑菌圈直徑之和/重復(fù)的次數(shù)。

1.2.5拮抗細(xì)菌鑒定

1.2.5.116S rDNA序列分析采用CTAB法[12]提取細(xì)菌的總DNA，以DNA為模板，以細(xì)菌16S rDNA（由上海捷瑞生物工程有限公司合成）為通用引物[13] [正向PF：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，對(duì)應(yīng)于大腸桿菌（Escherichia coli） 8～27 堿基；反向PR：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，對(duì)應(yīng)于大腸桿菌1 492～1 514堿基]，進(jìn)行16S rDNA片段的擴(kuò)增。

PCR的反應(yīng)體系（25.0 μL體系）：10×Buffer 2.5 μL、MgCl2 2.0 μL、dNTPs 2.0 μL、PF 1.2 μL、PR 1.2 μL、DNA模板 2.0 μL、Taq酶 0.25 μL、ddH2O 13.85 μL。

將PCR產(chǎn)物送于北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序完成后，將得到的序列與網(wǎng)站（WWW.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行對(duì)比和同源性分析。

1.2.5.2細(xì)菌培養(yǎng)特征觀察觀察單菌落的形態(tài)、大小、表面特征以及透明度，斜面細(xì)菌菌苔的生長(zhǎng)量、生長(zhǎng)型以及菌苔與培養(yǎng)基顏色，細(xì)菌在NA培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的混濁狀態(tài)、沉淀情況以及有無(wú)結(jié)膜現(xiàn)象，細(xì)菌在馬鈴薯塊上生長(zhǎng)情況、菌苔形態(tài)以及薯塊顏色變化情況。

1.2.5.3細(xì)菌革蘭氏染色和芽孢染色[14]革蘭氏染色：鏡檢時(shí)用油鏡觀察菌體，菌體呈藍(lán)紫色的為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+），成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。芽孢染色：將生有芽孢的細(xì)菌斜面菌苔按革蘭氏染色法涂片后，用飽和的孔雀綠水溶液染10 min，用清水沖洗；用番紅液復(fù)染30 s，水洗、吸干、鏡檢。被染后的芽孢呈紅色，菌體和芽孢囊呈微紅色。

2結(jié)果與分析

2.1土壤拮抗細(xì)菌篩選結(jié)果

從12份土樣中共分離細(xì)菌65株，經(jīng)過(guò)初篩后，獲得20株具有拮抗作用的細(xì)菌，其中平均抑菌圈直徑小于20 mm的有18株，2株拮抗細(xì)菌的平均抑菌圈直徑大于20 mm。將這20株具有拮抗作用的細(xì)菌進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)這20株拮抗細(xì)菌均表現(xiàn)出穩(wěn)定的抑制效果，其中平均抑菌圈直徑大于20 mm的2株細(xì)菌復(fù)篩的平均抑菌圈直徑仍然大于20 mm，編號(hào)為C3-5、C5-3，其抑菌圈的平均直徑分別為39.98、48.88 mm。平板噴霧法對(duì)峙效果見(jiàn)圖1。

表124 h后2株細(xì)菌對(duì)煙草青枯菌的抑菌圈直徑及形態(tài)的影響

拮抗細(xì)菌

編號(hào)抑菌圈平均

直徑（mm）抑菌圈形態(tài)C3-539.98半透明、邊緣較清晰、界限明顯C5-348.88 半透明、邊緣較清晰、界限明顯CK0無(wú)

2.2土壤拮抗細(xì)菌鑒定結(jié)果

2.2.116S rDNA序列分析結(jié)果細(xì)菌C3-5的16S rDNA區(qū)域基因序列與芽孢桿菌屬（Bacillus）中蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）的同源性達(dá)99%。細(xì)菌C5-3的16S rDNA區(qū)域基因序列與球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericus）的同源性達(dá)99%。

2.2.2細(xì)菌培養(yǎng)特征及染色結(jié)果表2、表3、圖2、圖3顯示，C3-5的培養(yǎng)特征、染色結(jié)果、菌體的形狀等特征與蠟樣芽孢桿菌的相同，與該菌的16S rDNA序列分析結(jié)果一致，因此可鑒定C3-5為蠟樣芽孢桿菌。 C5-3的16S rDNA區(qū)域表22株細(xì)菌培養(yǎng)特征

編號(hào)NA上菌落特征斜面菌苔特征液體培養(yǎng)特征（2 d）薯塊生長(zhǎng)特征（1 d）C3-5菌落大、圓形乳白色、生長(zhǎng)良好、擴(kuò)展?fàn)?、有絮狀沉淀生長(zhǎng)良好、易擴(kuò)散、不透明、粗糙、似蠟樣狀有小突起、乳白色

無(wú)結(jié)膜，無(wú)氣泡菌體乳白色、薯塊不變色C5-3菌落大、圓形乳白色、不透明、光滑、有同心圓生長(zhǎng)中等、無(wú)擴(kuò)展、乳白色

有絮狀沉淀有結(jié)膜、無(wú)氣泡

菌體白色、薯塊變褐色

表32株細(xì)菌染色特征

編號(hào)革蘭氏染色芽孢染色C3-5

陽(yáng)性、桿狀、末端方，常成短或長(zhǎng)鏈橢圓形或柱形、中生

C5-3

陽(yáng)性、桿狀至梭狀

圓形或卵圓形、中生偏頂生，直徑大于菌體

基因序列結(jié)果顯示與球形賴氨酸芽孢桿菌的同源性高，根文獻(xiàn)[15-16]鑒定的結(jié)果一致，可以確定該菌屬于球形賴氨酸芽孢桿菌。

3結(jié)論與討論

經(jīng)平板對(duì)峙法篩選獲得的拮抗細(xì)菌占所分離出來(lái)的土壤細(xì)菌的比例為27.69%。其中，獲得了拮抗效果最好的拮抗

細(xì)菌2株，分別是蠟樣芽孢桿菌和球形賴氨酸芽孢桿菌，且分離于不同的地方。

廣泛認(rèn)可芽孢桿菌屬中的多數(shù)細(xì)菌為良好的拮抗生防菌，如解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巴氏芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌和球狀芽孢桿菌都有降低植物病害發(fā)病率的作用[17]。余建等認(rèn)為，許多細(xì)菌具有生防作用，其中包括芽孢桿菌屬，不僅能夠防治棉花黃萎病、水稻稻瘟病、煙草青枯病和油菜菌核病，還能促進(jìn)煙株的生長(zhǎng)[18]。易有金等發(fā)現(xiàn)，短短芽孢桿菌對(duì)煙草青枯病具有較強(qiáng)的拮抗作用，經(jīng)過(guò)室內(nèi)和田間試驗(yàn)防效都較好[19]。這些結(jié)果與本研究相比，證明蠟樣芽孢桿菌是一株拮抗效果較好且較穩(wěn)定的生防菌。

本研究篩選出的另一株拮抗細(xì)菌為球形賴氨酸芽孢桿菌。目前，有研究報(bào)道可以利用該菌產(chǎn)生的生物錳氧化物吸附和回收金離子[16]以及該菌和嗜冷芽孢八疊球菌（Sporosarcina psychrophila）介導(dǎo)形成白云石晶體[20]，而該菌作為生防菌尚無(wú)報(bào)道。但是有關(guān)于球形芽孢桿菌（B. sphaericus）能作為生防菌的報(bào)道。劉波等報(bào)道，球形芽孢桿菌對(duì)青枯雷爾氏菌的強(qiáng)致病力菌株具有致弱作用[21]。周先治等發(fā)現(xiàn)球形芽孢桿菌的發(fā)酵上清液對(duì)青枯雷爾氏菌具有抑制作用[22]。由此可見(jiàn)，本研究篩選出效果最好的拮抗細(xì)菌，且作為與球形芽孢桿菌有關(guān)聯(lián)的細(xì)菌球形賴氨酸芽孢桿菌，在防治煙草青枯病上有很大的研究?jī)r(jià)值。

本研究同時(shí)也采用了平板噴霧法篩選拮抗放線菌，其抑菌圈形態(tài)比拮抗細(xì)菌抑菌圈的規(guī)整、透明度高，清晰明顯?？赡苁且?yàn)榉啪€菌菌落表面干燥，生長(zhǎng)不易受水分的影響，因此當(dāng)噴青枯菌液在它上面時(shí)，不受培養(yǎng)基中水分影響而生長(zhǎng)散亂。但是細(xì)菌卻不同，它喜歡在潮濕的環(huán)境下生長(zhǎng)，隨著水分的流動(dòng)而生長(zhǎng)形成不規(guī)則的形態(tài)。因此，平板對(duì)峙效果也只能證明在室內(nèi)篩選的結(jié)果，要確定真正的生防效果還有待進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)。

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本研究篩選出的另一株拮抗細(xì)菌為球形賴氨酸芽孢桿菌。目前，有研究報(bào)道可以利用該菌產(chǎn)生的生物錳氧化物吸附和回收金離子[16]以及該菌和嗜冷芽孢八疊球菌（Sporosarcina psychrophila）介導(dǎo)形成白云石晶體[20]，而該菌作為生防菌尚無(wú)報(bào)道。但是有關(guān)于球形芽孢桿菌（B. sphaericus）能作為生防菌的報(bào)道。劉波等報(bào)道，球形芽孢桿菌對(duì)青枯雷爾氏菌的強(qiáng)致病力菌株具有致弱作用[21]。周先治等發(fā)現(xiàn)球形芽孢桿菌的發(fā)酵上清液對(duì)青枯雷爾氏菌具有抑制作用[22]。由此可見(jiàn)，本研究篩選出效果最好的拮抗細(xì)菌，且作為與球形芽孢桿菌有關(guān)聯(lián)的細(xì)菌球形賴氨酸芽孢桿菌，在防治煙草青枯病上有很大的研究?jī)r(jià)值。

本研究同時(shí)也采用了平板噴霧法篩選拮抗放線菌，其抑菌圈形態(tài)比拮抗細(xì)菌抑菌圈的規(guī)整、透明度高，清晰明顯?？赡苁且?yàn)榉啪€菌菌落表面干燥，生長(zhǎng)不易受水分的影響，因此當(dāng)噴青枯菌液在它上面時(shí)，不受培養(yǎng)基中水分影響而生長(zhǎng)散亂。但是細(xì)菌卻不同，它喜歡在潮濕的環(huán)境下生長(zhǎng)，隨著水分的流動(dòng)而生長(zhǎng)形成不規(guī)則的形態(tài)。因此，平板對(duì)峙效果也只能證明在室內(nèi)篩選的結(jié)果，要確定真正的生防效果還有待進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)。

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本研究篩選出的另一株拮抗細(xì)菌為球形賴氨酸芽孢桿菌。目前，有研究報(bào)道可以利用該菌產(chǎn)生的生物錳氧化物吸附和回收金離子[16]以及該菌和嗜冷芽孢八疊球菌（Sporosarcina psychrophila）介導(dǎo)形成白云石晶體[20]，而該菌作為生防菌尚無(wú)報(bào)道。但是有關(guān)于球形芽孢桿菌（B. sphaericus）能作為生防菌的報(bào)道。劉波等報(bào)道，球形芽孢桿菌對(duì)青枯雷爾氏菌的強(qiáng)致病力菌株具有致弱作用[21]。周先治等發(fā)現(xiàn)球形芽孢桿菌的發(fā)酵上清液對(duì)青枯雷爾氏菌具有抑制作用[22]。由此可見(jiàn)，本研究篩選出效果最好的拮抗細(xì)菌，且作為與球形芽孢桿菌有關(guān)聯(lián)的細(xì)菌球形賴氨酸芽孢桿菌，在防治煙草青枯病上有很大的研究?jī)r(jià)值。

本研究同時(shí)也采用了平板噴霧法篩選拮抗放線菌，其抑菌圈形態(tài)比拮抗細(xì)菌抑菌圈的規(guī)整、透明度高，清晰明顯。可能是因?yàn)榉啪€菌菌落表面干燥，生長(zhǎng)不易受水分的影響，因此當(dāng)噴青枯菌液在它上面時(shí)，不受培養(yǎng)基中水分影響而生長(zhǎng)散亂。但是細(xì)菌卻不同，它喜歡在潮濕的環(huán)境下生長(zhǎng)，隨著水分的流動(dòng)而生長(zhǎng)形成不規(guī)則的形態(tài)。因此，平板對(duì)峙效果也只能證明在室內(nèi)篩選的結(jié)果，要確定真正的生防效果還有待進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

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