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        安祖花ISSR—PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化和確立

        2014-08-12 05:09:54楊京燕葛亞英田丹青
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年6期
        關(guān)鍵詞:單因素試驗(yàn)體系優(yōu)化

        楊京燕+葛亞英+田丹青

        摘要:為建立適宜安祖花DNA 的 ISSR-PCR 擴(kuò)增體系,采用單因子試驗(yàn)對(duì)影響 ISSR-PCR 反應(yīng)的各組分(Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+ 濃度)進(jìn)行了優(yōu)化,確立了適合安祖花的條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的最佳 ISSR-PCR 反應(yīng)體系,即在 20 μL PCR 反應(yīng)體系中含有10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物3.0 μL、20 ng/μL模板 2.0 μL;并利用2條引物對(duì)15個(gè)安祖花品種進(jìn)行了穩(wěn)定性鑒定,為安祖花的遺傳多樣性分析及育種工作提供技術(shù)支持。

        關(guān)鍵詞:安祖花;ISSR;單因素試驗(yàn);體系優(yōu)化

        中圖分類號(hào): S682.1+40.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2014)06-0038-03

        收稿日期:2014-03-12

        基金項(xiàng)目:浙江省杭州市種子種苗專項(xiàng)(編號(hào):20110332H14);臺(tái)州科技職業(yè)學(xué)院科研課題。

        作者簡(jiǎn)介:楊京燕(1977—),女,浙江臺(tái)州人,碩士,講師,從事園林規(guī)劃設(shè)計(jì)、園林花卉栽培與育種研究。E-mail:robinyjy@163.com。

        通信作者:葛亞英,碩士,助理研究員,主要從事花卉栽培與育種研究。E-mail:gyy954002@126.com。ISSR(inter-simlpe sequence repeat)是一種簡(jiǎn)單重復(fù)序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記,具有操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)成本低、DNA樣品用量少、多態(tài)性高、信息量大、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),已在品種鑒定、植物遺傳多樣性、物種的進(jìn)化關(guān)系、系統(tǒng)學(xué)比較與物種分類等研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[1],目前已成功用于觀賞鳳梨、菊花、萬(wàn)壽菊[2-4]等觀賞植物的遺傳多樣性、品種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。安祖花(Anthurium andraeanum Lind.)又名紅掌、花燭,是天南星科花燭屬多年生草本植物,具有奇特別致的葉形、色彩艷麗的佛焰苞和肉穗狀花序,已成為目前全球發(fā)展最快、需求量大的熱帶切花和盆栽花卉。安祖花品種繁多,深受消費(fèi)者喜愛的花色、株型或者具有較強(qiáng)抗病性、抗逆性的安祖花類型具有很高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,也是育種的主要目標(biāo)。欲獲得控制這些優(yōu)良性狀的基因,就需要建立適合安祖花的 DNA體外擴(kuò)增體系,繼而構(gòu)建遺傳圖譜,對(duì)基因進(jìn)行精確定位,加速育種工作進(jìn)程。本研究通過(guò)提取安祖花葉片的基因組總DNA,并對(duì)ISSR反應(yīng)體系中主要組分Taq DNA 聚合酶濃度、模板DNA 濃度、引物濃度、dNTPs 濃度、Mg2+濃度等進(jìn)行優(yōu)化,確立的ISSR反應(yīng)體系可為進(jìn)一步利用ISSR標(biāo)記技術(shù)開展安祖花種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、連鎖遺傳圖譜構(gòu)建和控制優(yōu)良性狀基因的 QTL 定位等方面奠定基礎(chǔ)。

        1材料與方法

        1.1材料

        供試材料為安祖花15個(gè)品種。

        1.2方法

        1.2.1基因組 DNA 提取用 CTAB 法提取基因組DNA[5],DNA質(zhì)量和濃度用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè),統(tǒng)一稀釋為20 ng/μL,保存于 -20 ℃ 冰箱中備用。

        1.2.2ISSR-PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增選用的引物根據(jù)British Columbia 大學(xué)公布的ISSR引物序列,由上海生工有限公司合成;10×Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、100 bp DNA marker 均購(gòu)自杭州鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。擴(kuò)增程序:94 ℃ 預(yù)變性3 min;94 ℃ 變性45 s,52 ℃ 復(fù)性45 s,72 ℃ 延伸 90 s,共42個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸 7 min后4 ℃ 保存。PCR 擴(kuò)增在美國(guó)ABI Applied Biosystems 2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

        1.2.3ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化試驗(yàn)試驗(yàn)在基本擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL反應(yīng)體系中,10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.0 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物2.0 μL、20 ng/μL模板 1.0 μL)的基礎(chǔ)上,以UBC834為引物,對(duì)模板DNA、Taq DNA聚合酶、引物、dNTPs和Mg2+ 5個(gè)影響ISSR-PCR擴(kuò)增的主要因素開展單因子濃度試驗(yàn),各反應(yīng)參數(shù)作4~6個(gè)水平的梯度優(yōu)化(表1),PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用 1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),確定各成分的最佳濃度,每個(gè)優(yōu)化好了的參數(shù)直接用于下一個(gè)優(yōu)化參數(shù)的反應(yīng)體系中。

        表1ISSR反應(yīng)體系優(yōu)化設(shè)計(jì)

        影響因子濃度梯度模板DNA(ng/μL)0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0Taq DNA聚合酶(U)0.50、0.75、1.00、1.25、1.50引物(μmol/L)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0MgCl2(mmol/L)1.0、1.5、2.0、2.5dNTPs(mmol/L)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0

        1.2.4ISSR反應(yīng)體系引物篩選及檢測(cè)根據(jù)優(yōu)化的ISSR反應(yīng)體系,選用2個(gè)品種對(duì)48 條ISSR引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物采用6% 非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳檢測(cè),確定多態(tài)性較好且條帶清晰的引物,選用其中2條引物對(duì)15個(gè)品種進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增檢測(cè)。

        2結(jié)果與分析

        2.1安祖花基因組DNA的提取

        將用CTAB 法提取15份安祖花葉片得到的 DNA,通過(guò)瓊脂糖跑膠和分光光度計(jì)測(cè)定其質(zhì)量和濃度,結(jié)果DNA條帶清晰,雜質(zhì)含量較少,可以滿足ISSR的試驗(yàn)要求。

        2.2安祖花ISSR-PCR體系的優(yōu)化

        2.2.1DNA模板量對(duì)PCR反應(yīng)的影響試驗(yàn)設(shè)置模板 DNA的終濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 ng/μL,結(jié)果DNA模板量在 0.5 ng/μL 時(shí)擴(kuò)增出的條帶較模糊,1.0~4.0 ng/μL時(shí)擴(kuò)增出的條帶清晰,容易判讀。通過(guò)多次重復(fù)比較試驗(yàn),在2.0 ng/μL的模板用量時(shí)最穩(wěn)定,且清晰,可以滿足安祖花ISSR-PCR 反應(yīng)的要求。

        2.2.2Taq DNA聚合酶濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響通過(guò)5種不同Taq DNA聚合酶用量比較,20 μL反應(yīng)體系中,Taq DNA聚合酶用量在0.5 U時(shí),擴(kuò)增條帶比較弱,且條帶數(shù)少;當(dāng)Taq酶用量為0.75~1.50 U時(shí),均能擴(kuò)增出明顯條帶。試驗(yàn)中Taq 酶用量為1.0 U時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰,確定Taq酶用量在1.0 U時(shí)最適合該P(yáng)CR體系。

        2.2.3引物濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響試驗(yàn)中引物濃度的變化對(duì)產(chǎn)物的多少和條帶的亮度影響較大,引物終濃度在 0.5~1.0 μmol/L 時(shí)雖然能擴(kuò)增出產(chǎn)物,但是條帶數(shù)少且有些擴(kuò)增條帶較弱;1.5~3.0 μmol/L時(shí)均能擴(kuò)增出清晰的條帶。經(jīng)重復(fù)比較,引物濃度為 1.5 μmol/L時(shí)反應(yīng)穩(wěn)定,條帶清晰且經(jīng)濟(jì),確定安祖花ISSR-PCR反應(yīng)最佳引物濃度為 1.5 μmol/L。

        2.2.4Mg2+濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響由可見,當(dāng)Mg2+ 終濃度為1.0 mmol/L時(shí),條帶很弱,幾乎看不清楚;隨濃度增大,擴(kuò)增條帶數(shù)增加,Mg2+ 終濃度為 1.5 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物最為豐富,且主帶最清晰。確定1.5 mmol/L為最適濃度。

        2.2.5dNTPs濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響當(dāng)dNTPs終濃度為1.0 mmol/L時(shí)未擴(kuò)增出條帶;0.6、0.8 mmol/L 時(shí)條帶缺失現(xiàn)象嚴(yán)重,且多數(shù)條帶模糊不清;當(dāng)dNTPs終濃度為0.2、0.4 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增帶型基本一致,但 0.4 mmol/L 時(shí)條帶最清晰穩(wěn)定,確定dNTPs最佳濃度為0.4 mmol/L。

        2.3ISSR-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性鑒定及確立

        根據(jù)各影響因子試驗(yàn)結(jié)果,以反應(yīng)體系中各組分最佳濃度進(jìn)行引物篩選,篩選得到的引物隨機(jī)選取2條,對(duì)15個(gè)品種進(jìn)行體系穩(wěn)定性鑒定,結(jié)果如圖7,引物U835和U846對(duì)每份DNA樣品均能擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性豐富的DNA片段,說(shuō)明該ISSR-PCR反應(yīng)體系是穩(wěn)定可靠的,適用于安祖花基因組DNA的ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。確立安祖花最終的 ISSR-PCR 反應(yīng)體系為20 μL反應(yīng)體系中10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物3.0 μL、20 ng/μL模板 2.0 μL,ddH2O補(bǔ)充至20 μL。

        3討論與結(jié)論

        有關(guān)ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的報(bào)道[6-9]很多,成分用量變化對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響很大。本研究采用單因素試驗(yàn),對(duì)影響ISSR-PCR的各個(gè)反應(yīng)因子進(jìn)行單獨(dú)的梯度試驗(yàn),找出最佳反應(yīng)條件。結(jié)果表明ISSR-PCR 反應(yīng)受反應(yīng)組分(Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物濃度、dNTPs、Mg2+ 濃度)變化影響,同時(shí)各組分均有一個(gè)相對(duì)適宜的用量范圍,濃度過(guò)低,不能滿足擴(kuò)增要求;濃度過(guò)高,又降低各組分的活性,影響擴(kuò)增效果。雖然ISSR-PCR 具有重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn),但不同反應(yīng)體系產(chǎn)生的結(jié)果也有可能不同[7],甚至同一種植物在不同的試驗(yàn)條件下研究結(jié)果都有差異[10]。張紅心等對(duì)16個(gè)紅掌種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR遺傳多樣性研究時(shí)采用的是25 μL ISSR反應(yīng)體系,其中含10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq酶、1.0 μmol/L 引物、1.5 ng/μL 模板[11]。本試驗(yàn)優(yōu)化后的ISSR體系中,除PCR Buffer含量與其一致外,其余組分含量均存在差異。

        通過(guò)篩選得到其中2條引物,對(duì)安祖花15個(gè)品種進(jìn)行ISSR擴(kuò)增分析,每個(gè)品種均能擴(kuò)增出清晰條帶,并且多態(tài)性均達(dá)100%。證明本研究確立的ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定、可靠,同時(shí)也說(shuō)明ISSR分子標(biāo)記適合對(duì)安祖花進(jìn)行遺傳多樣性分析。

        本試驗(yàn)建立的體系是采用單因素梯度試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行最佳組合的摸索,通過(guò)鑒定得到清晰穩(wěn)定的條帶,這一優(yōu)化的反應(yīng)體系可以用于安祖花遺傳多樣性的分析,為進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)安祖花資源鑒定、分類、分子遺傳圖譜的構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等分子生物學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

        參考文獻(xiàn):

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        2.2安祖花ISSR-PCR體系的優(yōu)化

        2.2.1DNA模板量對(duì)PCR反應(yīng)的影響試驗(yàn)設(shè)置模板 DNA的終濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 ng/μL,結(jié)果DNA模板量在 0.5 ng/μL 時(shí)擴(kuò)增出的條帶較模糊,1.0~4.0 ng/μL時(shí)擴(kuò)增出的條帶清晰,容易判讀。通過(guò)多次重復(fù)比較試驗(yàn),在2.0 ng/μL的模板用量時(shí)最穩(wěn)定,且清晰,可以滿足安祖花ISSR-PCR 反應(yīng)的要求。

        2.2.2Taq DNA聚合酶濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響通過(guò)5種不同Taq DNA聚合酶用量比較,20 μL反應(yīng)體系中,Taq DNA聚合酶用量在0.5 U時(shí),擴(kuò)增條帶比較弱,且條帶數(shù)少;當(dāng)Taq酶用量為0.75~1.50 U時(shí),均能擴(kuò)增出明顯條帶。試驗(yàn)中Taq 酶用量為1.0 U時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰,確定Taq酶用量在1.0 U時(shí)最適合該P(yáng)CR體系。

        2.2.3引物濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響試驗(yàn)中引物濃度的變化對(duì)產(chǎn)物的多少和條帶的亮度影響較大,引物終濃度在 0.5~1.0 μmol/L 時(shí)雖然能擴(kuò)增出產(chǎn)物,但是條帶數(shù)少且有些擴(kuò)增條帶較弱;1.5~3.0 μmol/L時(shí)均能擴(kuò)增出清晰的條帶。經(jīng)重復(fù)比較,引物濃度為 1.5 μmol/L時(shí)反應(yīng)穩(wěn)定,條帶清晰且經(jīng)濟(jì),確定安祖花ISSR-PCR反應(yīng)最佳引物濃度為 1.5 μmol/L。

        2.2.4Mg2+濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響由可見,當(dāng)Mg2+ 終濃度為1.0 mmol/L時(shí),條帶很弱,幾乎看不清楚;隨濃度增大,擴(kuò)增條帶數(shù)增加,Mg2+ 終濃度為 1.5 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物最為豐富,且主帶最清晰。確定1.5 mmol/L為最適濃度。

        2.2.5dNTPs濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響當(dāng)dNTPs終濃度為1.0 mmol/L時(shí)未擴(kuò)增出條帶;0.6、0.8 mmol/L 時(shí)條帶缺失現(xiàn)象嚴(yán)重,且多數(shù)條帶模糊不清;當(dāng)dNTPs終濃度為0.2、0.4 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增帶型基本一致,但 0.4 mmol/L 時(shí)條帶最清晰穩(wěn)定,確定dNTPs最佳濃度為0.4 mmol/L。

        2.3ISSR-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性鑒定及確立

        根據(jù)各影響因子試驗(yàn)結(jié)果,以反應(yīng)體系中各組分最佳濃度進(jìn)行引物篩選,篩選得到的引物隨機(jī)選取2條,對(duì)15個(gè)品種進(jìn)行體系穩(wěn)定性鑒定,結(jié)果如圖7,引物U835和U846對(duì)每份DNA樣品均能擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性豐富的DNA片段,說(shuō)明該ISSR-PCR反應(yīng)體系是穩(wěn)定可靠的,適用于安祖花基因組DNA的ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。確立安祖花最終的 ISSR-PCR 反應(yīng)體系為20 μL反應(yīng)體系中10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物3.0 μL、20 ng/μL模板 2.0 μL,ddH2O補(bǔ)充至20 μL。

        3討論與結(jié)論

        有關(guān)ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的報(bào)道[6-9]很多,成分用量變化對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響很大。本研究采用單因素試驗(yàn),對(duì)影響ISSR-PCR的各個(gè)反應(yīng)因子進(jìn)行單獨(dú)的梯度試驗(yàn),找出最佳反應(yīng)條件。結(jié)果表明ISSR-PCR 反應(yīng)受反應(yīng)組分(Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物濃度、dNTPs、Mg2+ 濃度)變化影響,同時(shí)各組分均有一個(gè)相對(duì)適宜的用量范圍,濃度過(guò)低,不能滿足擴(kuò)增要求;濃度過(guò)高,又降低各組分的活性,影響擴(kuò)增效果。雖然ISSR-PCR 具有重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn),但不同反應(yīng)體系產(chǎn)生的結(jié)果也有可能不同[7],甚至同一種植物在不同的試驗(yàn)條件下研究結(jié)果都有差異[10]。張紅心等對(duì)16個(gè)紅掌種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR遺傳多樣性研究時(shí)采用的是25 μL ISSR反應(yīng)體系,其中含10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq酶、1.0 μmol/L 引物、1.5 ng/μL 模板[11]。本試驗(yàn)優(yōu)化后的ISSR體系中,除PCR Buffer含量與其一致外,其余組分含量均存在差異。

        通過(guò)篩選得到其中2條引物,對(duì)安祖花15個(gè)品種進(jìn)行ISSR擴(kuò)增分析,每個(gè)品種均能擴(kuò)增出清晰條帶,并且多態(tài)性均達(dá)100%。證明本研究確立的ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定、可靠,同時(shí)也說(shuō)明ISSR分子標(biāo)記適合對(duì)安祖花進(jìn)行遺傳多樣性分析。

        本試驗(yàn)建立的體系是采用單因素梯度試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行最佳組合的摸索,通過(guò)鑒定得到清晰穩(wěn)定的條帶,這一優(yōu)化的反應(yīng)體系可以用于安祖花遺傳多樣性的分析,為進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)安祖花資源鑒定、分類、分子遺傳圖譜的構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等分子生物學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

        參考文獻(xiàn):

        [1]周延清,楊清香,張改娜. 生物遺傳標(biāo)記與應(yīng)用[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2008:166-167.

        [2]葛亞英,張飛,沈曉嵐,等. 麗穗鳳梨ISSR遺傳多樣性分析與指紋圖譜構(gòu)建[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(4):726-733.

        [3]繆恒彬,陳發(fā)棣,趙宏波,等. 應(yīng)用ISSR對(duì)25個(gè)小菊品種進(jìn)行遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(11):3735-3740.

        [4]曾麗,趙梁軍,孫佳,等. 萬(wàn)壽菊屬品種資源遺傳關(guān)系的ISSR分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(1):215-222.

        [5]葛亞英,沈曉嵐,田丹青. 紅掌基因組DNA提取試驗(yàn)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(1):64-65.

        [6]孫葉迎,陳麗飛,劉樹英,等. 長(zhǎng)白山區(qū)杓蘭屬植物ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系的建立[J]. 北方園藝,2013(24):92-95.

        [7]呂巖楨,王雷,張興旺,等. 山核桃ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,17(7):30-31,35.

        [8]邱長(zhǎng)玉,高國(guó)慶,陳伯倫,等. 茉莉花ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立[J]. 北方園藝,2008(2):214-217.

        [9]劉菲,李萍,何俊榮,等. 國(guó)蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 北方園藝,2011(17):136-139.

        [10]柴丹丹,陳書霞,孟煥文,等. 黃瓜SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,17(3):274-279.

        [11]張紅心,陳超,王桂蘭,等. 紅掌種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[C]//中國(guó)植物生理學(xué)會(huì).中國(guó)植物生理學(xué)會(huì)第十次會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編.2009:332.王楠,薛永來(lái),杜道林. 彗星試驗(yàn)檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷樣品制備方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(6):41-43.

        2.2安祖花ISSR-PCR體系的優(yōu)化

        2.2.1DNA模板量對(duì)PCR反應(yīng)的影響試驗(yàn)設(shè)置模板 DNA的終濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 ng/μL,結(jié)果DNA模板量在 0.5 ng/μL 時(shí)擴(kuò)增出的條帶較模糊,1.0~4.0 ng/μL時(shí)擴(kuò)增出的條帶清晰,容易判讀。通過(guò)多次重復(fù)比較試驗(yàn),在2.0 ng/μL的模板用量時(shí)最穩(wěn)定,且清晰,可以滿足安祖花ISSR-PCR 反應(yīng)的要求。

        2.2.2Taq DNA聚合酶濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響通過(guò)5種不同Taq DNA聚合酶用量比較,20 μL反應(yīng)體系中,Taq DNA聚合酶用量在0.5 U時(shí),擴(kuò)增條帶比較弱,且條帶數(shù)少;當(dāng)Taq酶用量為0.75~1.50 U時(shí),均能擴(kuò)增出明顯條帶。試驗(yàn)中Taq 酶用量為1.0 U時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰,確定Taq酶用量在1.0 U時(shí)最適合該P(yáng)CR體系。

        2.2.3引物濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響試驗(yàn)中引物濃度的變化對(duì)產(chǎn)物的多少和條帶的亮度影響較大,引物終濃度在 0.5~1.0 μmol/L 時(shí)雖然能擴(kuò)增出產(chǎn)物,但是條帶數(shù)少且有些擴(kuò)增條帶較弱;1.5~3.0 μmol/L時(shí)均能擴(kuò)增出清晰的條帶。經(jīng)重復(fù)比較,引物濃度為 1.5 μmol/L時(shí)反應(yīng)穩(wěn)定,條帶清晰且經(jīng)濟(jì),確定安祖花ISSR-PCR反應(yīng)最佳引物濃度為 1.5 μmol/L。

        2.2.4Mg2+濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響由可見,當(dāng)Mg2+ 終濃度為1.0 mmol/L時(shí),條帶很弱,幾乎看不清楚;隨濃度增大,擴(kuò)增條帶數(shù)增加,Mg2+ 終濃度為 1.5 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物最為豐富,且主帶最清晰。確定1.5 mmol/L為最適濃度。

        2.2.5dNTPs濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響當(dāng)dNTPs終濃度為1.0 mmol/L時(shí)未擴(kuò)增出條帶;0.6、0.8 mmol/L 時(shí)條帶缺失現(xiàn)象嚴(yán)重,且多數(shù)條帶模糊不清;當(dāng)dNTPs終濃度為0.2、0.4 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增帶型基本一致,但 0.4 mmol/L 時(shí)條帶最清晰穩(wěn)定,確定dNTPs最佳濃度為0.4 mmol/L。

        2.3ISSR-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性鑒定及確立

        根據(jù)各影響因子試驗(yàn)結(jié)果,以反應(yīng)體系中各組分最佳濃度進(jìn)行引物篩選,篩選得到的引物隨機(jī)選取2條,對(duì)15個(gè)品種進(jìn)行體系穩(wěn)定性鑒定,結(jié)果如圖7,引物U835和U846對(duì)每份DNA樣品均能擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性豐富的DNA片段,說(shuō)明該ISSR-PCR反應(yīng)體系是穩(wěn)定可靠的,適用于安祖花基因組DNA的ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。確立安祖花最終的 ISSR-PCR 反應(yīng)體系為20 μL反應(yīng)體系中10×PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物3.0 μL、20 ng/μL模板 2.0 μL,ddH2O補(bǔ)充至20 μL。

        3討論與結(jié)論

        有關(guān)ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的報(bào)道[6-9]很多,成分用量變化對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響很大。本研究采用單因素試驗(yàn),對(duì)影響ISSR-PCR的各個(gè)反應(yīng)因子進(jìn)行單獨(dú)的梯度試驗(yàn),找出最佳反應(yīng)條件。結(jié)果表明ISSR-PCR 反應(yīng)受反應(yīng)組分(Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物濃度、dNTPs、Mg2+ 濃度)變化影響,同時(shí)各組分均有一個(gè)相對(duì)適宜的用量范圍,濃度過(guò)低,不能滿足擴(kuò)增要求;濃度過(guò)高,又降低各組分的活性,影響擴(kuò)增效果。雖然ISSR-PCR 具有重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn),但不同反應(yīng)體系產(chǎn)生的結(jié)果也有可能不同[7],甚至同一種植物在不同的試驗(yàn)條件下研究結(jié)果都有差異[10]。張紅心等對(duì)16個(gè)紅掌種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR遺傳多樣性研究時(shí)采用的是25 μL ISSR反應(yīng)體系,其中含10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq酶、1.0 μmol/L 引物、1.5 ng/μL 模板[11]。本試驗(yàn)優(yōu)化后的ISSR體系中,除PCR Buffer含量與其一致外,其余組分含量均存在差異。

        通過(guò)篩選得到其中2條引物,對(duì)安祖花15個(gè)品種進(jìn)行ISSR擴(kuò)增分析,每個(gè)品種均能擴(kuò)增出清晰條帶,并且多態(tài)性均達(dá)100%。證明本研究確立的ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定、可靠,同時(shí)也說(shuō)明ISSR分子標(biāo)記適合對(duì)安祖花進(jìn)行遺傳多樣性分析。

        本試驗(yàn)建立的體系是采用單因素梯度試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行最佳組合的摸索,通過(guò)鑒定得到清晰穩(wěn)定的條帶,這一優(yōu)化的反應(yīng)體系可以用于安祖花遺傳多樣性的分析,為進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)安祖花資源鑒定、分類、分子遺傳圖譜的構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等分子生物學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

        參考文獻(xiàn):

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        [2]葛亞英,張飛,沈曉嵐,等. 麗穗鳳梨ISSR遺傳多樣性分析與指紋圖譜構(gòu)建[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(4):726-733.

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        [6]孫葉迎,陳麗飛,劉樹英,等. 長(zhǎng)白山區(qū)杓蘭屬植物ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系的建立[J]. 北方園藝,2013(24):92-95.

        [7]呂巖楨,王雷,張興旺,等. 山核桃ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,17(7):30-31,35.

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        [9]劉菲,李萍,何俊榮,等. 國(guó)蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 北方園藝,2011(17):136-139.

        [10]柴丹丹,陳書霞,孟煥文,等. 黃瓜SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,17(3):274-279.

        [11]張紅心,陳超,王桂蘭,等. 紅掌種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[C]//中國(guó)植物生理學(xué)會(huì).中國(guó)植物生理學(xué)會(huì)第十次會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編.2009:332.王楠,薛永來(lái),杜道林. 彗星試驗(yàn)檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷樣品制備方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(6):41-43.

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