鐘建橋 ，先德海 ，廖勇梅

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科,四川瀘州 646000，2.瀘州醫(yī)學(xué)院解剖教研室，四川瀘州 646000)

·論 著·

大蒜素對(duì)貝赫切特病的治療作用及機(jī)制探討*

鐘建橋1，先德海2，廖勇梅1

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科,四川瀘州 646000，2.瀘州醫(yī)學(xué)院解剖教研室，四川瀘州 646000)

目的 探討大蒜素對(duì)實(shí)驗(yàn)性貝赫切特病(BD)的治療作用及機(jī)制。方法 構(gòu)建BD模型鼠，將其分為實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，分別鼻飼注入大蒜素、秋水仙堿和生理鹽水。肉眼觀察治療前后皮損的變化，ELISA法檢測(cè)治療前后血清γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-4和化學(xué)比色法檢測(cè)總抗氧化力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)。結(jié)果 模型小鼠背、腹、陰部出現(xiàn)潰瘍，IFN-γ、TNF-α、IL-4和MDA升高，T-AOC、SOD和GSH-PX下降。治療20 d后實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠潰瘍基本愈合；30 d后實(shí)驗(yàn)組僅2只復(fù)發(fā)，陽(yáng)性對(duì)照組有6只復(fù)發(fā)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后實(shí)驗(yàn)組IFN-γ、TNF-α和IL-4較治療前降低(P<0.01)，與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組T-AOC、SOD和GSH-PX較治療前升高，MDA下降 (P<0.01)，與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 大蒜素是治療實(shí)驗(yàn)性BD的有效藥物，可能是通過(guò)抑制炎癥因子、阻止氧化應(yīng)激而作用。

貝赫切特綜合征；大蒜素；免疫反應(yīng)；氧化應(yīng)激

貝赫切特病(Behcet′s disease,BD)是一種慢性炎癥性多系統(tǒng)性血管炎，可累及皮膚黏膜、眼部等多個(gè)系統(tǒng)，迄今為止無(wú)滿意療法。盡管BD的確切機(jī)制不清，但大多認(rèn)為與遺傳、感染、免疫及氧化應(yīng)激等有關(guān)，而免疫紊亂和氧化應(yīng)激在其發(fā)病中起了重要作用[1-2]。大蒜素來(lái)源于大蒜，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗感染等作用，為BD的治療帶來(lái)新希望[3]。盡管大蒜素已被廣泛應(yīng)用于多種疾病，但在BD中的治療研究目前尚未見報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建BD動(dòng)物模型來(lái)觀察大蒜素的治療效果，同時(shí)檢測(cè)血清中免疫炎癥因子γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-4和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)總抗氧化力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)以探討大蒜素的治療機(jī)制，為BD臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物為4～5周大小的健康雄性ICR小鼠，共40只，平均體質(zhì)量約25 g，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)購(gòu)自武漢病毒研究所；大蒜素(江蘇正大清江制藥有限公司)；秋水仙堿片(云南植物藥業(yè)有限公司)。UV-1800pc紫外分光光度計(jì)(Mapada)、MODER-680酶標(biāo)測(cè)試儀(Bio-Rad，美國(guó))、低溫冰箱、超凈工作臺(tái)和電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱等。IFN-γ、TNF-α、IL-4、T-AOC、MDA、SOD和GSH-PX試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Millipore試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建BD動(dòng)物模型 選取40只健康雄性ICR小鼠，分為兩組：模型組30只、健康對(duì)照組10只。參照文獻(xiàn)[4]用針刺破小鼠耳垂，然后注入Ⅰ型HSV 1.0×106 U/mL，10 d 1次，共2次，16周后模型組小鼠均造模成功。健康對(duì)照組不作任何處理。造模期間密切觀察皮損的變化，并進(jìn)行攝像。小鼠在室溫20～22 ℃、12 h循環(huán)光照(每天早晨8:00開始)條件下進(jìn)行喂養(yǎng)。

1.2.2 藥物配制、實(shí)驗(yàn)分組與治療 (1)藥物配制：將20 mg/片的大蒜素以生理鹽水稀釋配制成濃度為25 μg/mL；秋水仙堿片(1 mg/片)以生理鹽水稀釋濃度為2 μg/mL。(2)分組：將造模成功的BD模型小鼠分為實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，每組各10只，分別注入大蒜素、秋水仙堿和生理鹽水。(3)治療方法：實(shí)驗(yàn)組每只以1 mL/d的劑量(即25 μg)經(jīng)鼻飼管注入大蒜素溶液，每天1次，連續(xù)20 d；應(yīng)用相同方法對(duì)陽(yáng)性對(duì)照組每只注入秋水仙堿1 mL/d(即2 μg)，陰性對(duì)照組每只注入相同量(1 mL/d)的生理鹽水。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè) 肉眼觀察治療前后鼠皮損變化：分別觀察治療前、治療結(jié)束后以及繼續(xù)喂養(yǎng)10 d后鼠、皮損的變化及復(fù)發(fā)情況。細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)：治療前和治療20 d后分別抽取小鼠晨起空腹靜脈血。采用ELISA法檢測(cè)血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4的水平，酶標(biāo)測(cè)試儀450 nm處讀數(shù)?；瘜W(xué)比色法檢測(cè)T-AOC和MDA、SOD、GSH-PX水平，分光光度計(jì)420～630 nm讀數(shù)。均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.4 BD動(dòng)物模型鑒定 經(jīng)典模型診斷標(biāo)準(zhǔn)包括主要癥狀和次要癥狀。主要癥狀為口腔、生殖器、皮膚的潰瘍和眼部損害。次要癥狀有關(guān)節(jié)炎、胃十二指腸潰瘍和神經(jīng)系統(tǒng)損害。病理組織變化為真皮層大量以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞聚集在血管周圍。BD樣小鼠至少要出現(xiàn)一種主要癥狀和一種次要癥狀或病理組織變化。如達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)可認(rèn)為BD動(dòng)物造模成功。

2 結(jié) 果

2.1 肉眼觀察動(dòng)物模型的BD樣癥狀和組織病理表現(xiàn) 模型組在注射HSV-1 16周后30只小鼠背部、腹部和外陰處出現(xiàn)大小不一深在潰瘍，伴少許滲液或結(jié)痂，同時(shí)出現(xiàn)不同程度的四肢活動(dòng)受限(關(guān)節(jié)炎)。在真皮層可見大量炎癥細(xì)胞(以淋巴細(xì)胞為主)圍繞血管周圍聚集。而健康對(duì)照組皮膚和外陰黏膜未見任何皮損，小鼠活動(dòng)良好，組織病理表現(xiàn)正常。根據(jù)BD經(jīng)典模型診斷標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)已成功構(gòu)建BD動(dòng)物模型30只，見圖1、2。

2.2 大蒜素等治療20 d后鼠皮損肉眼變化和30 d后復(fù)發(fā)情況 治療20 d后，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組潰瘍完全愈合，可見粉紅色新鮮瘢痕及皮膚生長(zhǎng)。陰性對(duì)照組而部分潰瘍?cè)龃?、增深，伴膿性分泌物。治?0 d后實(shí)驗(yàn)組2只小鼠背部可見一淺小潰瘍；陽(yáng)性對(duì)照組6只小鼠背腹部可見散在深淺不一潰瘍；陰性對(duì)照組部分潰瘍縮小，部分出現(xiàn)新潰瘍。治療30 d后實(shí)驗(yàn)組復(fù)發(fā)率為20%(2/10)，陽(yáng)性對(duì)照組為60%(6/10)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 大蒜素等治療前后鼠血清中IFN-γ、TNF-α和IL-4水平變化 造模后模型組IFN-γ、TNF-α和IL-4表達(dá)水平較健康對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，見表1。治療后實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組IFN-γ、TNF-α和IL-4表達(dá)水平均下降，較治療前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后陰性對(duì)照組IFN-γ、TNF-α、IL-4表達(dá)水平略有下降，但與治療前比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組分別與陰性對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

圖1 造模16周后模型鼠肉眼表現(xiàn)

圖2 造模16周后模型鼠組織病理表現(xiàn)(×200)表1 模型組與健康對(duì)照組血清細(xì)胞 因子水平比較

組別nIFN?γTNF?αIL?4模型組3037．51±18．03123．83±48．88116．15±37．99健康對(duì)照組304．63±1．8915．07±5．2313．21±5．05t5．71?6．96?8．47?

*：P<0.01，與健康對(duì)照組比較。

2.4 各組治療前后鼠血清中T-AOC、MDA、SOD和GSH-PX表達(dá)水平變化 造模后模型組T-AOC、SOD和GSH-PX表達(dá)水平較健康對(duì)照組降低(P<0.05)，而MDA較健康正常對(duì)照組升高(P<0.05)，見表2。治療后實(shí)驗(yàn)組T-AOC、SOD和GSH-PX表達(dá)水平升高，MDA下降，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而陽(yáng)性對(duì)照組治療前后比較僅SOD和GSH-PX升高明顯(P<0.05)，其余指標(biāo)及陰性對(duì)照組與治療前比較無(wú)明顯變化(P>0.05)；治療后實(shí)驗(yàn)組T-AOC、SOD和GSH-PX表達(dá)水平較陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組升高，MDA降低(P<0.05)，尤以T-AOC、MDA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療后陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組兩組間比較，其氧化相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

*：P<0.01，與治療前相應(yīng)細(xì)胞因子比較；#：P<0.01，與陰性對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)相應(yīng)細(xì)胞因子比較。

圖3 治療前后同組、治療后各組間IFN-γ、TNF-α 和IL-4表達(dá)水平比較表2 模型組與健康對(duì)照組血清氧化物水平比較±s)

*：P<0.05，**：P<0.01，與健康對(duì)照組比較。

*：P<0.01，#:P<0.05,與治療前相應(yīng)指標(biāo)比較；!：P<0.01，&：P<0.05,與陽(yáng)性對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)相應(yīng)指標(biāo)比較；$：P<0.01，與陰性對(duì)照組各指標(biāo)比較。

圖4 治療前后同組、治療后各組間T-AOC、MDA、SOD和GSH-PX表達(dá)水平比較

3 討 論

BD是一種以血管炎為基本病變的免疫性疾病，可累及全身多系統(tǒng)器官，若治療不及時(shí)可發(fā)生致命性的臟器損害。盡管一些傳統(tǒng)藥物對(duì)BD有一定療效，但難以治愈，停藥后易復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期使用可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重不良反應(yīng)[5]。而近年來(lái)采用的TNF-α抑制劑等生物制劑雖然治療BD有效，但因其潛在不良反應(yīng)或昂貴的費(fèi)用而應(yīng)用受限[6]。大蒜素為大蒜的一種活性成分，來(lái)源豐富，價(jià)額低廉無(wú)不良反應(yīng)，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用，尤其在防治心血管損傷的相關(guān)研究較多[3,7]。故在大蒜素廣泛用于治療心血管疾病等安全有效的啟示下，筆者推測(cè)大蒜素亦可治療嫡屬血管炎性疾病的BD，基于這一理論基礎(chǔ)本研究對(duì)大蒜素在BD中的治療作用及機(jī)制進(jìn)行了探討[8]。

為觀察大蒜素對(duì)BD的療效，筆者成功構(gòu)建了BD動(dòng)物模型，然后予以大蒜素等治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大蒜素和秋水仙堿均能有效促進(jìn)小鼠潰瘍愈合和新鮮皮膚生長(zhǎng)。尤其在治療30 d后，且實(shí)驗(yàn)組復(fù)發(fā)率僅為20%，而陽(yáng)性對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組卻有3倍的復(fù)發(fā)率，差異十分明顯。初步說(shuō)明大蒜素具有促進(jìn)BD潰瘍愈合，減少?gòu)?fù)發(fā)的作用。

為進(jìn)一步探討大蒜素對(duì)BD的治療作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)又對(duì)涉及BD發(fā)生、發(fā)展的重要免疫炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激指標(biāo)進(jìn)行了研究。通過(guò)檢測(cè)治療前后相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)：造模后小鼠IFN-γ、TNF-α、IL-4及MDA水平明顯升高，而T-AOC、SOD和GSH-PX顯著下降，符合BD的發(fā)病過(guò)程[9-10]。經(jīng)大蒜素等治療后，大蒜素和秋水仙堿能明顯降低IFN-γ、TNF-α和IL-4表達(dá)，減輕炎癥介質(zhì)的釋放。同時(shí)大蒜素能顯著增強(qiáng)T-AOC、SOD和GSH-PX表達(dá)，減少M(fèi)DA產(chǎn)生，較秋水仙堿能更好地上調(diào)SOD、GSH-PX活性、增強(qiáng)抗氧化能力、減少氧化物形成。這可能與大蒜素本身具有抗感染、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用，而秋水仙堿僅有免疫抑制而無(wú)抗氧化作用等有關(guān)；同時(shí)由于大蒜素具有抗氧化作用，可阻止氧化應(yīng)激損傷，秋水仙堿無(wú)此作用則使氧化應(yīng)激狀態(tài)持續(xù)存在，導(dǎo)致?lián)p害進(jìn)一步加重或反復(fù)發(fā)作，這也解釋了為什么大蒜素與秋水仙堿療效相當(dāng)，但復(fù)發(fā)率較低的原因。本實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)大蒜素具有抗氧化應(yīng)激損傷、減少ROS產(chǎn)生、抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用，這與國(guó)內(nèi)外較多報(bào)道結(jié)果相一致[11-12]。此外，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)秋水仙堿可使SOD和GSH-PX表達(dá)有所升高，但與生理鹽水比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與秋水仙堿抑制免疫炎癥介質(zhì)釋放導(dǎo)致SOD和GSH-PX破壞暫時(shí)減少，使之一過(guò)性升高有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素對(duì)實(shí)驗(yàn)性BD具有治療作用，且復(fù)發(fā)率低于秋水仙堿。其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制BD發(fā)病中的一些重要炎癥介質(zhì)的分泌和釋放，同時(shí)增強(qiáng)抗氧化力、減少氧化物形成，最終阻止BD組織細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)為初步探索，有待進(jìn)一步臨床實(shí)驗(yàn)和大樣本病例對(duì)照實(shí)驗(yàn)以證實(shí)。

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To investigate the treatment and mechanism of allicin on Behcet′s disease*

ZhongJianqiao1,XianDehai2,LiaoYongmei1

(1.DepartmentofDermatology,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China;2.DepartmentofHumanAnatomy,LuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

Abstract:Objective To explore the therapeutic effect and the mechanism of allicin on experimental Behcet′s disease (BD).Methods BD models were established.Then,model mice were randomly divided into experimental group,positive control group and negative control group,with respectively nasogastric infusion allicin,colchicine and saline respectively.Before and after treatment,the changes of the skin lesions were visually observed.Cytokines of IFN-γ,TNF-α and IL-4 in serum were detected by ELISA analysis,while the markers of T-AOC,MDA,SOD and GSH-PX by chemical colorimetric methods.Results After modeling,ulcers appeared on the back,abdomen and genital of model mice with IFN-γ,TNF-α,IL-4 and MDA elevation,while T-AOC,SOD and GSH-PX decrease.Twenty days of treatment later,ulcer on mice in the experimental group and positive control group healed.After 30 days,only two mice in the experimental group recurred,while 6 mice in the positive control group,which showed a significant difference between two groups (P<0.05).After treatment,IFN-γ,TNF-α and IL-4 levels in the experimental group were markedly lower than pretreatment (P<0.01),but no significant difference compared with the positive control group (P>0.05).Meanwhile,T-AOC,SOD and GSH-PX levels in the experimental group were significantly higher than those in the pretreatment,but MDA was lower (P<0.01).In comparison with the positive control group,levels of those markers in the experimental group changed remarkably (P<0.05).Conclusion Allicin is an effective drug in the treatment of experimental BD.The therapeutic mechanism of allicin may be the inhibition of inflammatory mediators and prevention of oxidative stress.

Behcet syndrome;allicin;immune response;oxidative stress

四川省衛(wèi)生廳項(xiàng)目資助(100283)。 作者簡(jiǎn)介：鐘建橋(1973-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事皮膚美容與炎癥性疾病的研究工作。

10.3969/j.issn.1671-8348.2014.32.001

R758.69

A

1671-8348(2014)32-4273-03

2014-01-20

2014-04-22)