羅燦蘭，田 虹，秦 偉，陳遠(yuǎn)壽

(遵義醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是一種由出血、缺血、缺氧性腦血管病引起的以癡呆為主要表現(xiàn)的慢性漸進(jìn)性智能障礙綜合征[1]。它嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，可VD造成的學(xué)習(xí)記憶功能障礙的具體機(jī)制還不十分明確，臨床上的治療方法目前效果欠佳。文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)活性的激活及變化與樹突棘的可塑性和學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)，而磷酸化CREB(pCREB)是CREB的活化形式，位其下游的大量基因如即刻早基因、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等基因的轉(zhuǎn)錄均受其調(diào)節(jié)，也參與了神經(jīng)元生存過(guò)程，以及學(xué)習(xí)記憶等重要作用[2-3]。絞股藍(lán)能否通過(guò)改變pCREB的表達(dá)量來(lái)影響小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能還未知。近來(lái)有研究報(bào)道，絞股藍(lán)總苷(Gprostemma Pentaphyllum Makino,GP)在缺血性腦損傷中能清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制鈣超載、減輕線粒體損傷，建立腦動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)、增加腦血流量，增強(qiáng)神經(jīng)活性作用[4-5]，對(duì)血管性癡呆的空間記憶和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)有改善作用[6]，顯示絞股藍(lán)總苷可能有神經(jīng)保護(hù)作用。我們先前的研究也證實(shí)絞股藍(lán)總苷可明顯改善VD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[7-8]。然而絞股藍(lán)改善血管性癡呆所致的學(xué)習(xí)記憶功能障礙的具體機(jī)制目前尚不清楚。為此，本研究拷貝小鼠血管性癡呆模型，觀察血管性癡呆小鼠以及絞股藍(lán)治療的VD小鼠海馬神經(jīng)元損傷和海馬組織pCREB mRNA表達(dá)變化情況，以探討絞股藍(lán)改善血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶功能及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 絞股藍(lán)總皂苷(含量>90%)，購(gòu)于東宇藥業(yè)有限公司；水合氯醛粉劑，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司提供；RNA抽提試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR用混合熒光引物，均由大連寶生物工程有限公司提供；蘇木精，成都貝斯特試劑有限公司提供。CM1800冰凍切片機(jī)，德國(guó)徠卡公司生產(chǎn)；熒光顯微鏡，日本Olympus生產(chǎn)；Icycler熒光定量PCR儀，美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)；Tu-1810紫外分光光度計(jì)，北京通用分析儀器公司生產(chǎn)；Centrifuge5415D離心機(jī)，德國(guó)Eppendof公司生產(chǎn)；BeckMAN coulTER離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 C57BL/6G 清潔健康雄性小鼠90只，體重22～25g，5周齡，采購(gòu)于重慶第三軍醫(yī)大野戰(zhàn)外科研究所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK-(軍)2002008。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后隨機(jī)將雄性C57BL小鼠80只分為5組：假手術(shù)組(Sham組)、血管性癡呆模型組(VD組)、血管性癡呆+絞股藍(lán)處理組(GP低、中、高劑量組)，每組16只。每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物又分24、72 h進(jìn)行觀測(cè)。

1.3 制備血管性癡呆模型與給藥 運(yùn)用反復(fù)夾阻小鼠2側(cè)頸總動(dòng)脈致缺血-再灌注制作血管性癡呆模型。術(shù)前小鼠禁食8 h ，不禁水。腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100g麻醉，仰臥位固定，備皮后消毒頸正中切口，小心地鈍性分離左、右側(cè)頸總動(dòng)脈，避開頸動(dòng)脈竇及神經(jīng)用小動(dòng)脈夾夾雙側(cè)頸總動(dòng)脈使頸總動(dòng)脈阻閉，造成腦缺血10 min，放開動(dòng)脈夾再灌注20 min，如此反復(fù)3次。術(shù)后保持室內(nèi)溫度26 ℃。假手術(shù)組小鼠同法麻醉后分離2側(cè)頸總動(dòng)脈，僅穿線，不阻斷血流。

術(shù)前3 d及術(shù)后24、72 h的每天早晨分別給絞股藍(lán)處理組小鼠腹腔注射1次絞股藍(lán)皂苷稀釋液(低、中、高劑量：100、200、400 mg/kg) 。VD模型組及假手術(shù)組腹腔注射等容積生理鹽水，療程及次數(shù)與GP處理組相同。

1.4 腦組織HE染色 將小鼠稱重后予10%水合氯醛0.35 mL/100g腹腔注射麻醉，仰臥位固定，剪開上腹部并夾緊劍突向上翻，暴露及剪開胸腔隔膜，打開胸腔且暴露心臟。輕輕將注射器針頭從左心室插入主動(dòng)脈，止血鉗固定針頭，剪開右心耳，先灌注0.9%生理鹽水50 mL，接著灌注4%多聚甲醛50 mL，見小鼠尾部變硬并翹起。迅速斷頭，小心地取出完整腦組織，放置于4%多聚甲醛進(jìn)行后固定，4 ℃過(guò)夜，分別予4 ℃15%、30%蔗糖依次脫水，每次均沉底。將修飾好的腦組織放入卡諾氏固定液中固定后依次進(jìn)行洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(組織厚6 μm)、貼片，烘干貼好組織的載玻片后進(jìn)行脫蠟復(fù)水，蘇木精染色15 min后依次水洗、分色、漂洗、脫水、復(fù)染(0.5%伊紅乙醇)、再脫水、透明、封片。

1.5 pCREB表達(dá)的檢測(cè)

1.5.1 樣品采集與處理 小鼠斷頭處死后在冰盤上迅速取腦，取出左、右側(cè)完整海馬，將兩側(cè)海馬放于盛有0.5 mL trizol的EP管中，-80 ℃凍存。取50 mg凍存的海馬組織，依次進(jìn)行解凍，勻漿，離心，萃取，沉淀，空干，提取出總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNAA260/A280的值在1.8～2.0，說(shuō)明RNA質(zhì)量好，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。RT-PCR反應(yīng)測(cè)定海馬組織pCREB的含量。

1.5.2 pCREB mRNA的表達(dá)測(cè)定 環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因序列根據(jù)基因庫(kù)并用Primer 5.0分析軟件設(shè)計(jì)得到，再磷酸化成磷酸化環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白。用同一軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參基因β-actin 與CREB。定量PCR 引物序列及反應(yīng)條件(見表1)。運(yùn)用RT-PCR 方法檢測(cè)海馬組織pCREB mRNA的表達(dá)水平。

表1基因引物序列及反應(yīng)條件

基因名稱 引物序列 產(chǎn)物片段/bp退火溫度/ ℃β-actin上游 TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC下游 GCTCGTTGCCAATAGTGATGACC14957pCREB上游 TGGCTAACAATGGTACGGATGG下游 CTGGGCACTAGAATCTGCTGTCC13359

2 結(jié)果

2.1 絞股藍(lán)對(duì)血管性癡呆小鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響 造模后72h海馬組織HE染色顯示，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密、整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核為橢圓形或圓形(見圖1A)；血管性癡呆模型組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)細(xì)胞多見片狀壞死，其數(shù)目減少明顯，細(xì)胞排列雜亂，細(xì)胞核邊界模糊、多固縮(見圖1B)；血管性癡呆+絞股藍(lán)低劑量處理組錐體神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目稍多，層次排列整齊(見圖1C)；血管性癡呆+絞股藍(lán)中、高劑量處理組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多，少見明顯片狀壞死，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰、排列較緊密、整齊，少見細(xì)胞核固縮(見圖1D、E)。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C～E：絞股藍(lán)處理組(低、中、高劑量組)；(HE×400)。圖1 絞股藍(lán)干預(yù)72h后對(duì)血管性癡呆小鼠海馬組織神經(jīng)元損傷的影響

2.2 海馬組織pCREBmRNA的表達(dá)情況 與假手術(shù)組比較，VD 模型組海馬組織 pCREBmRNA 的表達(dá)水平均顯著降低(P<0. 05)；與VD模型組相比，血管性癡呆+絞股藍(lán)低、中、高劑量處理組海馬組織pCREBmRNA 表達(dá)量均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0. 05) ；血管性癡呆+絞股藍(lán)低、中、高劑量處理組間差異無(wú)統(tǒng)學(xué)意義(P>0.05)，pCREBmRNA的表達(dá)量呈遞增趨勢(shì)(見表2) 。結(jié)果表明絞股藍(lán)總苷可使血管性癡呆小鼠海馬組織pCREB的表達(dá)量提高，并且在短期內(nèi)低、中、高劑量間無(wú)明顯量效關(guān)系。

組別 劑量(mg/kg)24h72h假手術(shù)組_1.58±0.041.66±0.04模型組_1.43±0.06*1.31±0.03*低劑量組1001.69±0.03#1.46±0.04#中劑量組2001.70±0.05#1.50±0.10#高劑量組4001.71±0.08# 1.51±0.32#

注：與假手術(shù)組比：*P< 0.05；與模型組比：#P< 0.05。

3 討論

反復(fù)腦缺血再灌注后，可誘導(dǎo)某些對(duì)缺血敏感的腦區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞即早基因快速表達(dá)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，是造成血管性癡呆(VD)的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，海馬組織CA1區(qū)是缺血缺氧最為敏感的區(qū)域，最易發(fā)生神經(jīng)元選擇性遲發(fā)型死亡，而海馬區(qū)組織的神經(jīng)細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物或患者的認(rèn)知功能障礙，造成學(xué)習(xí)記憶減退，乃至發(fā)生癡呆[9-12]。本實(shí)驗(yàn)采用c57BL6/G小鼠反復(fù)夾閉2側(cè)頸總動(dòng)脈3次以拷貝VD模型，組織學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目明顯減少，呈片狀壞死，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[1,11]。提示，反復(fù)腦缺血再灌注后海馬神經(jīng)元細(xì)胞死亡可能是小鼠發(fā)展成VD的原因之一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與VD模型組小鼠比較，絞股藍(lán)處理組小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰、排列較緊密、整齊，少見細(xì)胞核固縮及細(xì)胞脫落壞死。結(jié)果表明，絞股藍(lán)對(duì)海馬神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。

為進(jìn)一步研究絞股藍(lán)對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究了與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的關(guān)鍵分子環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)。早期研究發(fā)現(xiàn)缺失CREB的突變型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能受損明顯[13]。而磷酸化的CREB(pCREB)才能與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合，誘導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄，參與神經(jīng)元的生長(zhǎng)過(guò)程，對(duì)學(xué)習(xí)記憶有重要作用[2-3]。pCREB的水平變化可影響神經(jīng)元突觸的可塑性與學(xué)習(xí)記憶能力[2-3]。正常小鼠經(jīng)過(guò)水迷宮訓(xùn)練后可提高學(xué)習(xí)能力，且測(cè)定海馬組織pCREB的含量增高[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VD 模型組海馬組織 pCREB mRNA 的表達(dá)水平比假手術(shù)組均顯著降低；絞股藍(lán)低、中、高劑量處理組海馬組織pCREB mRNA 表達(dá)量比VD模型組均明顯增加，差異顯著。本課題組先前的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，絞股藍(lán)可明顯改善VD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[7]。提示，刺激VD小鼠海馬CREB的轉(zhuǎn)錄活性可能是絞股藍(lán)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)及其促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶作用的機(jī)制之一。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，絞股藍(lán)總皂苷可保護(hù)VD所致的小鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元損傷，提高VD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與上調(diào)海馬CA1錐體神經(jīng)元pCREB mRNA 表達(dá)有關(guān)。這為探討絞股藍(lán)總皂苷的神經(jīng)保護(hù)作用和提高學(xué)習(xí)記憶能力的分子機(jī)制補(bǔ)充了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。

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