陳峻崧，楊 潔，邵家勝，洪曉武

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇 南京 210009；2.江蘇先聲藥業(yè)有限公司,江蘇 南京 210042；3.上海復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心 內(nèi)科學(xué)系，上海 201508；4.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系，上海 200032)

卵巢癌是發(fā)病率第3位的女性生殖器惡性腫瘤，占女性惡性腫瘤的5%。但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科腫瘤的首位[1-2]；中國女性的卵巢癌發(fā)病率為3.8/10萬，每年有1.2萬人死于卵巢癌[3]。卵巢癌復(fù)發(fā)率高，五年生存率僅有15%～30%，主要原因是耐藥而導(dǎo)致的復(fù)發(fā)[2，4]。卵巢癌干細胞(Ovarian Cancer Stem cells,OCSCs)常被描述為與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、抗輻射、耐藥和復(fù)發(fā)密切相關(guān)的腫瘤細胞[5-6]，含量極低。OCSCs作為卵巢癌治療中的重要靶細胞，OCSCs生物學(xué)特性的研究日益增多，在人上皮卵巢癌(Human Epithelial ovarian cancer,EOC)中分離的一部分表型為CD44+CD117+的細胞，被證實具有更高的順鉑和紫杉醇耐受性和在裸鼠中具有高致瘤性[7]。但是針對OCSCs的靶向抗腫瘤藥物仍未被開發(fā)出，因此，深入了解OCSCs的耐藥機制，尋找靶向消滅OCSCs的藥物是治愈卵巢癌的關(guān)鍵。

1 資料與方法

1.1 人OCSCs分選收集對數(shù)生長期的人EOC HO8910細胞 用免疫磁珠分選(magnetic-activated cell sorting,MACS)Buffer(MACS- Runnning Buffer:PBS pH 7.2 + 2 mM EDTA +0.5% BSA)重懸細胞，白細胞計數(shù)板鏡下計數(shù)，每107個細胞重懸于80 μL Buffer中；CD44磁珠抗體標記，每107個細胞加入20 μL的CD44磁珠單抗，混勻后4 ℃冰箱中孵育15 min；采用LS Columns柱，正性分選，過柱收集CD44+細胞后計數(shù)。再加入100 μLCD117磁珠單抗，混勻后在4 ℃冰箱中孵育45 min，再次過柱收集CD44+CD117+細胞，計數(shù)、放入培養(yǎng)瓶中，加入干細胞培養(yǎng)液，注意無菌操作。

1.2 人OCSCs的無血清培養(yǎng)與鑒定 CD44+CD117+細胞加入干細胞培養(yǎng)液在培養(yǎng)瓶中置37 °C、5%CO2飽和濕度條件下常規(guī)細胞培養(yǎng)。無血清干細胞培養(yǎng)液[7]為DMEM/F12培養(yǎng)基加入5 μg/mL牛胰島素，20 ng/mL人重組表皮生長因子，10 ng/mL成纖維生長因子和0.4%牛血清白蛋白配制而成；流式細胞術(shù)(Flow Cytometer，F(xiàn)CM)檢測分選的EOC CD44+CD117+細胞表面CD44和CD117分子表達，每100 μL含待測細胞的反應(yīng)體系先后加入0.5 μg FITC 標記的CD44+單克隆抗體[8]和5 μL PE標記的CD117+單克隆抗體[9]，4 ℃孵育30 min；用PBS洗滌3次，每次3 min，重懸于400 μL PBS中；FCM檢測，設(shè)HO8910細胞為對照組，未加單抗的細胞為陰性對照。

1.3 MTT法檢測細胞對化療藥物的耐受性 選取處于生長對數(shù)期的CD44+CD117+和HO8910細胞計數(shù)將細胞懸液接種于96孔板中，設(shè)3個復(fù)孔；在各細胞組中分別加入抗腫瘤藥物，具體濃度見表1。將已加入藥物的96孔板放入孵箱，在37 ℃、5%CO2及飽和濕度環(huán)境下，靜止培養(yǎng)72 h；加入5 mg/mL MTT 及SDS三聯(lián)液靜置12 h；酶標儀490 nm波長測各孔的吸光度值，以空白對照孔調(diào)零，記錄結(jié)果。

表1 5種抗腫瘤藥物的濃度(μM)及分組情況

藥物濃度組12345678910卡鉑12562.531.315.67.83.91.950.980.490.24紫杉醇62.531.315.67.83.92.00.980.490.240.12順鉑120072043225915693.35633.620.212.15-FU1000800400200100502512.56.253.125阿霉素10033.311.13.71.230.410.140.050.020.005

1.4 實時熒光定量PCR(q-PCR)檢測 檢測卵巢癌細胞HO8910及其OCSCs(表達CD44+CD117+)的ABCG2、ABCB1、Nanog、MMP-2和MMP-9及β-actin基因表達。各引物序列(見表2)，均由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成，純度為PAGE級。使用TAKARA公司的PrimeScript?RT試劑盒，按照產(chǎn)品說明書的操作步驟，進行相關(guān)試劑的配比和實驗，得到cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄合成的樣品的cDNA產(chǎn)物作為模板，采用SYBR?GreenI20 μL反應(yīng)體系，配制PCR反應(yīng)液進行qPCR擴增，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。以ddH2O為模板設(shè)陰性對照，電腦采集每個循環(huán)的ct值。比較各組間的差異有無顯著性，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 以上實驗重復(fù)3次，獲取平均值所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0分析軟件包進行統(tǒng)計處理，各組間差異采用方差分析(ANOVA)，多樣本均數(shù)之間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 ABCG2,ABCB1,Nanog,β-actin,MMP-2和MMP-9引物序列

基因Gene IDRT-PCR引物序列ABCG29429上游5’-GGCTTATACGGCCAGTTCCA-3’下游5’-GTCCGTTACATTGAATCCTGGAC-3’ABCB15243上游5’-CGAATGTCTGAGGACAAGCCAC-3’下游5’-CCATGAGGTCCTGGGCATG-3’Nanog71950上游5’-GGGCCTGAAGAAAACTATCCATCC-3’下游5’-TGCTATTCTTCGGCCAGTTGTTTT-3’β-actin69642上游5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’下游5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’MMP-24313上游5’-CGTTTGATGGCAAGGATGGAC-3’下游5’-GCCATCAGCGTTCCCACTTTAC-3’MMP-981687上游5’-CGCTGGGCTTAGATCATTCC-3’下游5’-GTGCCGGATGCCATTCAC-3’

2 結(jié)果

2.1 分選的EOC細胞表面CD44+CD117+表達情況 細胞分選前(見圖1A)，HO8910細胞表面CD44和CD117皆為陽性的CD44+CD117+細胞占1%±1.7%，而CD44和CD117皆為陰性的CD44-CD117-細胞占82.2%±3.7%；CD44+CD117-細胞占13.8%±2.1%，CD44-CD117+細胞占1.2%±0.6%。細胞分選后(見圖1B)，細胞表面CD44和CD117皆為陽性的CD44+CD117+細胞占84.2%±9.4%，而CD44和CD117皆為陰性的CD44-CD117-細胞占2%±0.5%；CD44+CD117-細胞占15.1%±3.3%，CD44-CD117+細胞占0.4%±0.2%。表明經(jīng)過免疫磁珠分選后，原本僅占極少數(shù)的CD44+CD117+細胞1%±1.7%，獲得了富集，比例大大上升84.2%±9.4%，P<0.01。

注：A:為免疫磁珠分選前HO8910細胞；B:為免疫磁珠分選后CD44+CD117+細胞。圖1 EOCHO8910細胞免疫磁珠分選前后FCM檢測表達CD44+CD117+細胞比例

2.2 細胞生長狀態(tài)變化 人EOCHO8910細胞株在無血清干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d，細胞呈鋪路石狀，貼壁生長2 d后部分細胞脫落，懸浮于培養(yǎng)基中。7 d后，大部分細胞凋亡，大量的細胞碎片懸浮于培養(yǎng)基中(見圖2A-C)。HO8910CD44+CD117+細胞在無血清干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，仍能夠進行擴增，形成多個團狀、腺泡狀結(jié)構(gòu)(見圖2D-F)。對照組HO8910細胞在完全培養(yǎng)基中呈貼壁狀生長(見圖2G-I)。

2.3 細胞對化療藥物的耐藥性 不同濃度的化療藥物作用下，各組細胞表現(xiàn)出劑量依賴性的細胞生長抑制率，細胞生長抑制率越低表示該細胞的耐藥性就越強(見圖3)。在中濃度梯度區(qū)間CD44+CD117+細胞比HO8910細胞顯現(xiàn)出更強的耐藥性(P<0.05)。5-FU藥物組表現(xiàn)為：在高濃度梯度時(1～3用藥組)CD44+CD117+細胞與HO8910細胞耐藥性無差別(P>0.05)，而在中低濃度梯度區(qū)間(4～10用藥組)CD44+CD117+細胞明顯比HO8910細胞更為耐藥(P<0.05)?？ㄣK藥物組中，CD44+CD117+細胞和HO8910細胞呈現(xiàn)劑量正相關(guān)性的細胞抑制率曲線，即隨著藥物作用濃度的升高，兩組細胞生長抑制率液逐漸升高。除最高劑量(125 μM)外，CD44+CD117+細胞比HO8910細胞顯現(xiàn)出更強的耐藥性(P<0.05)。順鉑和紫杉醇用藥組中兩細胞組表現(xiàn)類似的耐藥現(xiàn)象，即在高濃度梯度時(1～4用藥組)CD44+CD117+細胞與HO8910細胞耐藥性無差別(P>0.05)，細胞抑制率都達到80%以上；而在中濃度梯度區(qū)間(5～8用藥組)CD44+CD117+細胞明顯比HO8910細胞更為耐藥(P<0.05)。而低濃度梯度區(qū)間(9～10用藥組)，由于用藥濃度較低，表現(xiàn)為各組細胞都有較強的生存能力，抑制率較低，CD44+CD117+細胞與HO8910細胞耐藥能力無顯著差別(P>0.05)。阿霉素組中，在高中濃度梯度時(1～4用藥組)CD44+CD117+細胞與HO8910細胞耐藥性無差別(P>0.05)，都表現(xiàn)出較高的細胞生長抑制率(80%以上)。而在中低濃度梯度區(qū)間(5～10用藥組)CD44+CD117+細胞明顯比HO8910細胞更為耐藥(P<0.05)。

注：A-C為HO8910細胞在無血清干細胞培養(yǎng)基中，分別經(jīng)過1、2、7 d后的生長情況；D-F為HO8910CD44+CD117+細胞在無血清干細胞培養(yǎng)基中，經(jīng)過1、2 和7 d后的生長情況；G-I為HO8910細胞在完全培養(yǎng)基中，經(jīng)過1、2、7 d后的生長情況(A-H：放大倍數(shù)×100，I：放大倍數(shù)×400)。圖2 EOCHO8910細胞及其CD44+CD117+細胞體外培養(yǎng)生長狀態(tài)

注：*P<0.05。圖3 HO8910細胞及其CD44+CD117+細胞對5種化療藥物不同濃度藥敏試驗的結(jié)果

2.4 q-PCR檢測相關(guān)基因表達 HO8910細胞及CD44+CD117+細胞經(jīng)過總RNA提取，進行q-PCR對比研究。結(jié)果顯示(見圖4)CD44+CD117+細胞的ABCG2,ABCB1,Nanog,MMP-2和MMP-9基因mRNA表達水平都高于同樣培養(yǎng)條件下的HO8910細胞(P<0.05)，ABCG2基因mRNA表達水平，CD44+CD117+細胞是HO8910細胞11倍；與HO8910細胞相比，CD44+CD117+細胞ABCB1、Nanog、MMP-2和MMP-9基因mRNA表達水平分別是前者的7.6倍、2.5倍、5.5倍和6倍。

注：*P<0.05,**P<0.01。圖4 q-PCR檢測HO8910細胞及CD44+CD117+細胞的ABCG2,ABCB1,Nanog,MMP-2和MMP-9mRNA表達

2.5 腫瘤干細胞耐藥作用機制(見圖5)。

圖5 腫瘤干細胞耐藥作用機制及相關(guān)特征分子標記

3 討論

研究顯示，卵巢癌復(fù)發(fā)率高，5年生存率僅有15%～30%[1]，主要原因可能是腫瘤干細胞引起的耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移所致[4]。因此，尋找靶向消滅腫瘤干細胞的藥物或提高其對化療藥物的敏感性是治愈卵巢癌的關(guān)鍵[10]。由于腫瘤干細胞僅占腫瘤細胞中的極少部分0.04%～0.2%[11]，較難獲得，因此，首先要獲得具有干細胞特性的一部分腫瘤細胞，經(jīng)過培養(yǎng)、化療藥物耐藥實驗，深入了解其耐藥作用機制，為腫瘤干細胞生物學(xué)特征研究、靶向抗腫瘤藥物研發(fā)等奠定基礎(chǔ)。

干細胞因子受體(stem cell factor receptor，SCFR)，即CD117是一種跨膜的酪氨酸激酶受體，大小為145kD，在多種腫瘤中廣泛存在的癌蛋白[12]。在卵巢癌細胞中，CD117+的細胞比例非常低，在0.5%～3%[13]。Zhang等[7]報道，在人卵巢癌組織中分離出一部分高表達CD44和CD117的腫瘤細胞，在體外培養(yǎng)形成獨立的、具有自我更新能力的細胞球。這些CD44+CD117+細胞具有高致瘤性和體內(nèi)重建卵巢癌等特性，僅用100個CD44+CD117+細胞即可使裸鼠致瘤。CD44+CD117+細胞具有腫瘤干細胞相關(guān)特征，可能是一種OCSCs。

目前腫瘤干細胞的分離方法通常通過細胞表面特異性標志篩選[7]、無血清培養(yǎng)富集[14]、SP細胞分選等[15]。本實驗利用免疫磁珠分選方法，以磁珠直接標記的人CD44和CD117單克隆抗體，從人EOCHO8910細胞株中分選獲得了比例為84.1%±9.4%的CD44+CD117+細胞。進而使用了目前臨床上治療卵巢癌的一線化療藥物，如紫杉醇、卡鉑、順鉑、5-FU等5種化療藥物，比較CD44+CD117+細胞和EOCHO8910細胞的耐藥性差異。結(jié)果顯示從HO8910細胞分離的CD44+CD117+細胞，對卡鉑、順鉑、紫杉醇和5-FU、阿霉素化療藥物的耐藥性也明顯強于HO8910細胞。說明CD44+CD117+細胞除了具有腫瘤干細胞相關(guān)表型外，還具有較強的化療藥物耐藥性。卵巢癌一線化療方案疾病控制率長可達到90%以上，但是腫瘤患者3年的復(fù)發(fā)率達到40%以上[1]。具有較強耐藥性的CD44+CD117+細胞未被化療藥物完全殺滅可能是導(dǎo)致卵巢癌復(fù)發(fā)的原因之一。因此，針對CD44+CD117+細胞等具有腫瘤干細胞樣特征的腫瘤細胞進行靶向治療和特異性殺傷，是治愈卵巢癌的關(guān)鍵。

腫瘤干細胞表現(xiàn)出耐藥性，可能是其表面或細胞外基質(zhì)高表達一些受體或蛋白相關(guān)，如ABCG2,ABCB1。而腫瘤干細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移與Nanog,MMP-2和MMP-9蛋白的表達密切相關(guān)(見圖5)。在q-PCR試驗中發(fā)現(xiàn)，在同等培養(yǎng)條件下OCSCs中ABCG2、ABCB1、Nanog、MMP-2和MMP-9mRNA基因明顯高于HO8910細胞表達水平；已知ABCG2和ABCB1基因是一種ATP綁定的盒式轉(zhuǎn)運體，能夠主動將進入細胞內(nèi)部的化療藥物和毒性物質(zhì)泵出胞外，從而避免細胞被殺傷。因此其高表達與腫瘤干細胞耐藥密切相關(guān)[16]。OCSCs中ABCG2和ABCB1基因表達升高，可能是其具有較高耐藥性的機制之一，研究具有靶向ABCG2和ABCB1分子的抗腫瘤藥物將可能是有效殺滅腫瘤干細胞的一個思路[17]。MMPs是一類鋅依賴的蛋白家族，是水解細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的蛋白裂解酶，包括ECM及整合于質(zhì)膜中的各種膠原酶和彈性蛋白酶等，在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用[18]。MMP-2和MMP-9作為MMPs蛋白家住中最為重要的成員，與腫瘤干細胞在體內(nèi)的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。OCSCS高表達MMP-2和MMP-9mRNA，也提示CD44+CD117+細胞可能具有高的侵襲性。Nanog基因主要與腫瘤干細胞保持未分化狀態(tài)有關(guān)[19]，在多種腫瘤干細胞中高表達[20]，CD44+CD117+EOC細胞高表達Nanog基因，提示該群細胞的低分化狀態(tài)，可能也是維持OCSCs未分化狀態(tài)和高增殖能力的重要轉(zhuǎn)錄因子和分子機制之一。如何提高OCSCs對化療藥物的敏感性，提高藥物的腫瘤干細胞殺傷效率，仍是需要不斷探索的重要課題，分子靶向治療是否在這一領(lǐng)域可發(fā)揮重要作用，還有待進一步研究證實。

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