林紅賽，黃永富，李 劍，岳衛(wèi)華

(北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，北京101111)

雷帕霉素洗脫支架系統(tǒng)中雷帕霉素的含量測(cè)定

林紅賽，黃永富，李 劍，岳衛(wèi)華

(北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，北京101111)

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定雷帕霉素洗脫支架中雷帕霉素含量測(cè)定的方法并對(duì)樣品制備方法進(jìn)行了驗(yàn)證。方法：用waters 1525高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱為C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶水(67∶15∶18)，流速1mL/min，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長為280nm，外標(biāo)法定量。結(jié)果：雷帕霉素的線性范圍為19.2～77.6μg/mL(r=0.9993)，檢出限為0.388μg/mL，平均加樣回收率為98.86%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于雷帕霉素洗脫支架系統(tǒng)中雷帕霉素的含量測(cè)定。

雷帕霉素洗脫支架；雷帕霉素；高效液相色譜法

0 引言

雷帕霉素又稱西羅莫司，是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有抑制血管平滑肌增殖、抑制血管內(nèi)膜增生的作用。該藥物覆蓋于支架表面，可起到防止血管再狹窄的作用。目前雷帕霉素洗脫支架在國內(nèi)臨床上應(yīng)用已較為普遍，而雷帕霉素洗脫支架產(chǎn)品還沒有相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)可做質(zhì)量評(píng)價(jià)參考。文獻(xiàn)已有反相高效液相色譜法測(cè)定組織中或藥物中的雷帕霉素的含量，但尚無雷帕霉素洗脫支架產(chǎn)品中雷帕霉素含量測(cè)定方法，所以建立一種適用于雷帕霉素洗脫支架中雷帕霉素含量測(cè)定的準(zhǔn)確方法十分必要。本實(shí)驗(yàn)旨在建立評(píng)價(jià)雷帕霉素洗脫支架中雷帕霉素含量的測(cè)定方法并對(duì)樣品的制備方法的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料和方法

Waters高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器(Waters公司)；電子天平(梅特勒-托利多公司)；雷帕霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度HPLC≥98%，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)；甲醇(色譜純，Merck KGaA)；乙腈(色譜純，Mreda technology Inc)；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

(1)實(shí)驗(yàn)條件

色譜柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇∶乙腈∶水= 67∶15∶18；流速：1mL/min；檢測(cè)波長：280nm。

(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取對(duì)照品9.7mg，加入乙腈溶解并定容至25mL，得到濃度為388μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液適量用乙腈逐級(jí)稀釋，得到濃度為19.2μg/mL、29.1μg/mL、38.8μg/mL、48.5μg/mL、58.2μg/mL和77.6μg/mL一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

(3)樣品的制備

取支架1個(gè)，放入5mL棕色瓶中，精密加入5mL乙腈，靜置1h，超聲10min，用0.45μm濾膜過濾，取濾液作為檢驗(yàn)液。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長的選擇

將配制好的雷帕霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液用紫外分光光度計(jì)在190～700nm波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素在280nm處有最大的吸收峰，故選擇280nm作為檢測(cè)波長。波長掃描圖見圖1。

圖1 雷帕霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液掃描圖

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

取濃度為38.8μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液一份，按“(1)”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果表明雷帕霉素及其異構(gòu)體分離良好，雷帕霉素保留時(shí)間約為11min，理論塔板數(shù)大于3000，拖尾因子1.1；雷帕霉素異構(gòu)體保留時(shí)間約為13.48min，理論塔板數(shù)大于5000，拖尾因子1.1，色譜圖見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液色譜圖

2.3 線性范圍

取標(biāo)準(zhǔn)溶液按“(1)”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積(A)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=33722.8189C-130752.1；r=0.9993，該結(jié)果表明在19.2～77.6μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以響應(yīng)值較低的雷帕霉素異構(gòu)體計(jì)算檢出限，當(dāng)稀釋對(duì)照品溶液濃度至0.388μg/mL時(shí)，其信噪比(S/N)等于4.0，故檢出限約為0.388μg/mL(S/N=4.0)。

2.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液5份，按“(1)”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，RSD為0.91%(n=5)。

室溫放置0h、4h和8h后的同一標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“(1)”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算雷帕霉素峰面積的RSD為1.3%。該結(jié)果表明雷帕霉素的乙腈溶液制備后室溫放置至少8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知濃度的樣品溶液9份，分別加入低、中、高三種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)試3份，按“(1)”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，低、中、高濃度的平均回收率分別為98.66%、99.18和98.73，總平均回收率為98.86%。

Table 1 Results of recovery test

2.7 樣品制備方法的確定和測(cè)定結(jié)果

1)取按“(3)”項(xiàng)下洗脫后的支架，置于新的容器中，加入2.5mL乙腈溶劑，并確保支架完全浸沒于溶劑中，超聲30min，用0.45μm濾膜過濾，取濾液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)雷帕霉素色譜峰。

2)取樣品，按“(3)”項(xiàng)下制備樣品，按“(1)”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算檢驗(yàn)液中雷帕霉素的含量，結(jié)果測(cè)得單個(gè)支架中雷帕霉素含量為141.04μg。

4 小結(jié)

(1)雷帕霉素在溶液中存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，異構(gòu)體色譜峰與雷帕霉素色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間約為1.2min，在計(jì)算雷帕霉素含量時(shí)可將色譜圖中的雷帕霉素峰和雷帕霉素異構(gòu)體峰合并計(jì)算。

(2)單個(gè)雷帕霉素洗脫支架在5mL乙腈中靜置1h后，發(fā)現(xiàn)少量白色的涂層材料已被洗脫下來，故測(cè)定前需要過濾。洗脫后的支架再次超聲洗脫未發(fā)現(xiàn)雷帕霉素色譜峰，表明靜置1h后超聲10min的處理方法已能使支架中的雷帕霉素完全洗脫下來。

(3)本文建立了雷帕霉素洗脫支架高效液相色譜檢測(cè)方法，并對(duì)方法的有效性和樣品的制備方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示本方法具有靈敏、快速、方便之特性，可以滿足雷帕霉素洗脫支架含量測(cè)定的要求。

[1]陳宏林，尤慶生，孟小勇.HPLC法測(cè)定組織中雷帕霉素的含量[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志，2008，25 (7) ：813-814.

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Determination of rapamycin in rapamycin -eluting stent by HPLC

LIN Hong-sai, HUANG Yong-fu, LI Jian, YUE Wei-hua

(No.7, Xingguang 2nd Street, Opto-Mechatronics Industial Park, Tongzhou District, Beijing, China, 101111)

Objective:To establish a method for determination of rapamycin in rapamycin-eluting stent by HPLC with ultraviolet detection and verify the efficiency of sample preparation. Method: HPLC analysis of rapamycin was performed by a Waters 1525 chromatography equipped with a C18 (250mm×4.6mm, 5μm) column and quantified by external standard method. The mobile phase was a mixture of methanol, acetonitrile and water (67∶15∶18) and the flow rate was 1mL/min. The detection wavelength was at 280nm.Result: The linear range of rapamycin was 19.2μg/mL～77.6μg/mL(r=0.9993).The limt detection was 0.388μg/mL and the average recovery was 98.86%. Conclusion: The method is simple, rapid and accurate for the content determination of rapamycin in rapamycin -eluting stent.

rapamycin ; rapamycin -eluting stent;HPLC

2014-01-15

R972

A

1002-2376(2014)08-0007-03