吳劍平，范乃兵，鞠曉云，卞 勇

(南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，南京 210032)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常要采集血液進(jìn)行各種指標(biāo)分析。在大鼠藥代動(dòng)力學(xué)等研究中，則需短時(shí)間內(nèi)多次采集血液。研究[1]報(bào)道，采血本身會(huì)引起動(dòng)物應(yīng)激，某些采血方法甚至?xí)饎?dòng)物局部組織的嚴(yán)重?fù)p傷甚至是動(dòng)物死亡。因此，選擇合適的采血方法，對(duì)于有效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。眼眶靜脈叢采血和舌下靜脈采血均可用于大鼠實(shí)驗(yàn)期間的連續(xù)多次采血，且其采血量可滿足一般藥代、藥效、血常規(guī)、生化等常用指標(biāo)的分析。實(shí)際應(yīng)用中，眼眶靜脈叢采血是目前普遍采用的采血方法，舌下靜脈采血?jiǎng)t應(yīng)用相對(duì)較少。但研究報(bào)道眼眶靜脈叢采血會(huì)造成動(dòng)物眼睛局部的嚴(yán)重?fù)p傷，甚至是失明，從動(dòng)物福利角度考慮不宜用于實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物仍需存活情況下的采血。而舌下靜脈采血?jiǎng)t對(duì)動(dòng)物局部組織的損傷較小[2]，可作為眼眶靜脈叢采血的替代方法。本研究通過(guò)觀察這2種采血方法的連續(xù)多次采血對(duì)大鼠應(yīng)激神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)的影響，從動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)程度進(jìn)一步比較這2種采血方法的優(yōu)劣。

1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量(220±10) g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[SCXK(滬)2012-0002]。拜安康血糖儀Contour TS(德國(guó))，Bio-Tek Elx800 USA酶標(biāo)儀(美國(guó))，拜安康血糖試紙(德國(guó)),皮質(zhì)酮(CORT)和β-內(nèi)啡肽(β-EP)試劑盒(美國(guó)RB公司)。實(shí)驗(yàn)方法：Wistar大鼠飼養(yǎng)在屏障設(shè)施[SYXK(蘇)2012-0042]中，按照國(guó)標(biāo)GB 14925-2010的有關(guān)要求控制環(huán)境參數(shù)。實(shí)驗(yàn)前先給予5 d健康適應(yīng)期，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲食。Wistar大鼠隨機(jī)均分為3組，分為采血組和對(duì)照組。各采血組分別在1 h內(nèi)采血3次,處理如下：1)眼眶靜脈叢采血組：水合氯醛麻醉下，分別在0、20、60 min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用毛細(xì)管從大鼠一側(cè)眼眶靜脈叢穿刺每次采集血液0.5 mL。相鄰采血點(diǎn)采集大鼠對(duì)側(cè)眼眶。2)舌下靜脈采血組：水合氯醛麻醉下，分別在0、20、60 min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用5 mL注射針頭刺破大鼠舌下靜脈，每次采集血液0.5 mL。采血后立即用干棉球按壓止血。 兩采血組每次采血前均先用血糖試紙測(cè)定大鼠血糖(GLU)。3次采血結(jié)束后均立即采樣，在10%水合氯醛0.3 mL/100 g劑量麻醉下通過(guò)腹主動(dòng)脈采血2 mL，分離血清，于-20 ℃保存，用ELISA法測(cè)定CORT和β-EP水平。各組采血和采樣時(shí)間均控制在每日8:30～11:30。

對(duì)照組處理:適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，于8:30～11:30直接采樣，在水合氯醛麻醉下通過(guò)腹主動(dòng)脈采血2 mL，分離血清，于-20 ℃保存，用ELISA法測(cè)定CORT和β-EP水平。

2 結(jié)果

2.1 GLU的測(cè)定結(jié)果 不同采血點(diǎn)之間GLU比較,眼眶靜脈叢采血組20 min采血點(diǎn)較0 min采血點(diǎn)有顯著性升高(P<0.05)，60 min采血點(diǎn)較20 min采血點(diǎn)有顯著性降低(P<0.05)；舌下靜脈采血組20 min采血點(diǎn)較0 min采血點(diǎn)有極顯著性降低(P<0.01)，60 min采血點(diǎn)較20 min采血點(diǎn)無(wú)顯著性變化(P>0.05)。

表1 各采血組GLU的測(cè)定結(jié)果(n=10) mmol/L

注：與0 min比較，#P<0.05，##P<0.01；與20 min比較，△P<0.05

2.2 CORT和β-EP的測(cè)定結(jié)果 與對(duì)照組比較,眼眶靜脈叢采血組和舌下靜脈采血組的CORT均有極顯著性升高(P<0.01)，眼眶靜脈叢采血組和舌下靜脈采血組的β-EP均無(wú)顯著性變化(P>0.05)。

表2 各采血組GLU的測(cè)定結(jié)果(n=10)

注：與對(duì)照組比較，##P<0.01

3 討論

研究[3-4]表明，采血、給藥、保定等常規(guī)操作均會(huì)引起動(dòng)物的應(yīng)激。動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)越強(qiáng)烈，則該操作對(duì)動(dòng)物福利的損害越大。過(guò)強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)甚至可能會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果產(chǎn)生背景性干擾。因此，比較不同操作引起的動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)程度，有助于篩選出相對(duì)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法。應(yīng)激會(huì)引起機(jī)體一系列神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)的改變，本研究即通過(guò)觀察眼眶靜脈叢采血和舌下靜脈采血2種方法的連續(xù)3次采血對(duì)Wistar大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)的影響,比較這2種方法造成的大鼠應(yīng)激程度，篩選出相對(duì)優(yōu)化的采血方法。

下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸(HPA軸)是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)中最重要的神經(jīng)內(nèi)分泌軸之一[5]。皮質(zhì)酮(CORT)作為HPA軸的終末效應(yīng)激素，為目前評(píng)價(jià)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)程度的經(jīng)典指標(biāo)。本研究顯示，采用眼眶靜脈叢和舌下靜脈2種采血方法在1h內(nèi)連續(xù)采血3次后,均造成了大鼠CORT的明顯升高，提示這2種采血均引起了動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)。應(yīng)激反應(yīng)中CORT的分泌可促進(jìn)糖異生，進(jìn)而引起血糖的升高[5]。因此,血糖的變化也是反映機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)程度的重要指標(biāo)[6]。本研究同時(shí)在每次采血前均測(cè)定了大鼠的血糖值。研究表明，即使在麻醉狀態(tài)下，眼眶靜脈叢采血仍會(huì)引起大鼠血糖的進(jìn)一步升高，20 min后血糖才開始緩慢下降。而舌下靜脈采血組大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，繼續(xù)采血時(shí)大鼠血糖不再升高，且在20 min內(nèi)即迅速恢復(fù)至正常水平，再次采血時(shí)血糖仍維持在較低水平。因此，本研究提示大鼠對(duì)舌下靜脈采血的適應(yīng)性較眼眶靜脈叢采血好。

β-EP是應(yīng)激反應(yīng)中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，也是評(píng)價(jià)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的常用指標(biāo)[7-8]。本研究中，采用上述2種采血方法連續(xù)3次采血后，大鼠的β-EP水平均無(wú)顯著性變化。研究報(bào)道，同種應(yīng)激原反復(fù)刺激機(jī)體時(shí)，會(huì)引起某些應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)的適應(yīng)性反饋抑制，再次應(yīng)激時(shí)該指標(biāo)不再變化[9]。提示重復(fù)多次采血應(yīng)激可能造成了β-EP的反饋性抑制，也提示該指標(biāo)不適宜用于重復(fù)應(yīng)激的程度評(píng)價(jià)。

綜上可知，眼眶靜脈叢采血會(huì)造成大鼠強(qiáng)烈而持久的應(yīng)激反應(yīng)，而大鼠對(duì)舌下靜脈采血應(yīng)激的適應(yīng)性較快，同時(shí)考慮到眼眶靜脈叢采血對(duì)大鼠眼部組織的損傷性較大，舌下靜脈采血對(duì)局部組織的損傷性較小。因此，從動(dòng)物福利綜合角度考慮，在需保留活體動(dòng)物時(shí)，建議以舌下靜脈采血代替眼眶靜脈叢采血作為實(shí)驗(yàn)期間大鼠較大劑量采血的首選方法。

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