蒲寶嬋，李愛主，方 玲

(天津中醫(yī)藥大學，天津 300193)

近年來，原發(fā)性痛經(jīng)發(fā)病率逐年升高，臨床上開始用經(jīng)前3～7 d給藥來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的生理周期用藥[1-3]，且以連續(xù)治療3個月經(jīng)周期為1療程[4-5]。本文根據(jù)這一臨床治療方法，在前期工作基礎上[6-7]，通過動物實驗來觀察不同時機給藥對原發(fā)性痛經(jīng)模型小鼠雌激素受體(ER-α)和縮宮素受體(OTR)表達的影響。

1 實驗材料

經(jīng)前3劑止痛方JQF(當歸、益母草、川芎、赤芍、桂枝)，購自天津?？滇t(yī)院，并經(jīng)生藥學鑒定；元胡止痛片，天津同仁堂集團股份有限公司(30 mg/片)。給藥劑量均參考了臨床用藥劑量，并根據(jù)體表面積折算成小鼠每日給藥劑量所得。KM小鼠，雌性未孕，18～22 g，SPF級，購自北京華阜康實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證:SCXK(京)2013-0004。苯甲酸雌二醇注射液，寧波市三生藥業(yè)有限公司(2 mL∶4 mg，生產(chǎn)批號：120904)；縮宮素注射液，上海禾豐制藥有限公司(1 mL∶10 u，生產(chǎn)批號:130115)。OTR和ER-α均購自北京博奧森生物技術有限公司，RT-PCR 試劑盒，美國Promega公司；BCA蛋白定量試劑盒，碧云天生物技術公司；凝膠成像分析儀(Cuene Genins)；實時定量PCR儀(Linegene9620)，杭州博日科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 造模與給藥 60只小鼠按體質量分層隨機分為JQF整個動情周期給藥組(以下簡稱JQF動情周期給藥組)、JQF每個周期的第4天給藥組(以下簡稱JQF第4天給藥組)、元胡止痛片組、模型組和正常組，每組12只。根據(jù)小鼠動情周期天數(shù)[8]，將造模時間定為6 d，除正常組外各組小鼠每日皮下注射苯甲酸雌二醇0.2 mg/只。JQF動情周期給藥組(0.218 g/kg)和元胡止痛片組(0.1 g/kg)每日灌胃給以相應藥物(0.2 mL/10 g)，連續(xù)6 d,JQF第4天給藥組(0.218 g/kg)小鼠每個周期的第4天開始給藥至周期結束(共3 d)，正常組和模型組每日灌胃相應體積的生理鹽水。待6 d造模給藥結束后，從各組中隨機抽取6只小鼠檢測1周期給藥治療對ER-α和OTR表達的影響，剩余小鼠按上述方法連續(xù)造模給藥18 d(3個周期)后，再檢測3周期連續(xù)給藥治療后的實驗結果。

2.2 取材 動物處死后，立即開腹暴露子宮，將子宮周圍脂肪和系膜剝離干凈，按左右位置分為兩段取出子宮，使子宮內組織液流出，用濾紙吸凈后稱重，取同只同位段子宮組織用錫紙包裹，放- 80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 Western blot檢測ER-α和OTR蛋白的表達 用含有蛋白酶抑制劑混合物的裂解液提取子宮組織中的蛋白，根據(jù)蛋白含量檢測試劑盒說明進行蛋白質定量。取10 μL蛋白在5%濃縮膠、10%分離膠的SDS-PAGE凝膠上樣，經(jīng)過電泳、轉膜后4 ℃過夜保存，孵育相應一抗。取出后于室溫下用TBST清洗5次，每次5 min。室溫下孵育二抗1 h，再次洗滌后進行ECL曝光，應用Bio imaging system圖像處理系統(tǒng)分析條帶光密度值。

2.4 Real-time PCR檢測ER-α和OTR mRNA的表達 ER-α和OTR引物序列如下：OTR:sense:5’ GAT GTC GCT CGA CCG CTG TCT 3’;anti-sense:5’ CGC CCA GCA ATC GAA GAC TCC 3’(172 bp);ER-α:Sense:5’ CAC ACC AAA GCC TCG GGA ATG 3’，anti-sense:5’ TAG TTG AAC ACA GTG GGC TTG 3’(146 bp);β-actin:sense:5’ TCA GGT CAT CAC TAT CGG CAA 3’;anti-sense:5’A GC ACT GTG TTG GCA TAG AGG 3’(169 bp)。用變性緩沖液(Trizol)一步法提取子宮組織中的總RNA，按試劑盒說明逆轉錄為cDNA,在預變性95 ℃ 10 min，變性94 ℃ 20 s，退火延伸59 ℃ 20 s，共40個循環(huán)的反應條件下完成基因的擴增。用2—△△Ct來表示每個目的基因的相對表達量[9]。

3 實驗結果

3.1 ER-α和OTR蛋白的表達情況 從圖1和圖2中可以看出,正常組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較，JQF第4天給藥組、JQF動情周期給藥組和元胡止痛片組1周期給藥治療后小鼠子宮組織中ER-α、OTR蛋白的表達顯著降低(P<0.01),且第4天給藥組和動情周期給藥組組間比較無差異。從圖中也可以看出，3周期連續(xù)造模給藥實驗結果與1周期一致，且對ER-α和OTR蛋白表達的抑制作用更加顯著。

3.2 ER-α和OTR mRNA的表達情況 從圖3和圖4中可以看出，正常組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較,JQF第4天給藥組和JQF動情周期給藥組1周期給藥治療后小鼠子宮組織中ER-α、OTR mRNA的表達顯著降低(P<0.01)，且2組組間比較無差異，3周期連續(xù)造模給藥實驗結果與1周期一致。元胡止痛片組給藥后ER-α mRNA的表達1周期實驗結果與3周期一致，均呈顯著性降低(P<0.01)，而OTR mRNA的表達1周期給藥治療后明顯降低(P<0.05)，3周期連續(xù)造模給藥后結果顯著(P<0.01)。

Z：正常組；H：JQF第4天給藥組；Q：JQF動情周期給藥組；Y：元胡止痛片組；M：模型組。**表示與模型組比較,P<0.01。圖1

Z：正常組；H：JQF第4天給藥組；Q：JQF動情周期給藥組；Y：元胡止痛片組；M：模型組。**表示與模型組比較,P<0.01。圖2

Z：正常組；H：JQF第4天給藥組；Q：JQF動情周期給藥組；Y：元胡止痛片組；M：模型組。**表示與模型組比較,P<0.01。圖3

Z：正常組；H：JQF第4天給藥組；Q:JQF動情周期給藥組；Y：元胡止痛片組；M：模型組。**表示與模型組比較,P<0.01。圖4

4 討論

經(jīng)前3劑止痛方(JQF)是臨床治療原發(fā)性痛經(jīng)的有效方劑，在前期研究結果中發(fā)現(xiàn)在患者的黃體退化期用藥治療效果更為顯著[10]。本研究根據(jù)這一結果提示，選取相當于人體黃體退化期的雌性小鼠動情周期后3 d用藥[8](即從每個周期的第4天開始給藥)作為另一給藥時機,與整個動情周期用藥作比較來觀察這兩組不同時機給藥對原發(fā)性痛經(jīng)模型小鼠子宮組織中ER-α和OTR表達的影響。

現(xiàn)代研究認為，原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)生主要是由于雌激素(E2)和縮宮素(OT)水平的異常升高，所導致的子宮痙攣性收縮、缺血而引起的[11]。E2的生物學效應強弱與靶細胞內雌激素受體(ER)的水平密切相關[12]。ER-α作為ER的主要亞型之一，在子宮中起主導作用，可以通過對子宮蠕動的調節(jié)來改變子宮收縮強度,以減輕痛經(jīng)程度。OT與OTR結合后可以通過作用于子宮平滑肌細胞，引起子宮收縮而致痛，還可通過引發(fā)子宮小動脈持久而強烈的收縮，使子宮肌層組織缺血而致痛[13]，所以痛經(jīng)程度的大小與OTR 的表達密切相關。 實驗結果顯示，小鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型復制成功，實驗結果有效。與模型組比較,JQF周期的第4天給藥與整個動情周期給藥均可以顯著抑制ER-α和OTR蛋白、mRNA的表達,3周期連續(xù)造模給藥與1周期結果一致，且兩組組間比較均無差異，說明周期的第4天給藥與整個動情周期給藥對原發(fā)性痛經(jīng)模型小鼠ER-α和OTR蛋白、mRNA具有相同的治療作用，且3個周期連續(xù)造模給藥后結果依然有效，從動物實驗初步體現(xiàn)了臨床上月經(jīng)來潮前開始用藥與整個生理周期用藥治療原發(fā)性痛經(jīng)具有相同的治療效果。

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