曹 越，田淋淋，李 航，張美雙，宗 穎，劉 冬，張 輝*，孫佳明*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，長(zhǎng)春 130117)

鹿茸為鹿科動(dòng)物梅花鹿CervusNipponTemminck或馬鹿CervuselaphusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。前者習(xí)稱“花鹿茸”，后者習(xí)稱“馬鹿茸”。馬鹿茸按產(chǎn)地分為東馬鹿茸和西馬鹿茸[1]。鹿茸是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥之一，其含有的化學(xué)成分十分復(fù)雜，主要有蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)，還含有豐富的氨基酸，脂肪酸，微量元素等[2-4]。目前，由于我國(guó)市場(chǎng)上的鹿茸藥材大部分來(lái)源于梅花鹿，導(dǎo)致大量的梅花鹿茸易混品與偽品混入了藥材市場(chǎng)，所以建立全面、系統(tǒng)地控制梅花鹿茸品質(zhì)的分析方法十分重要。HPLC指紋圖譜技術(shù)是評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的一種快速簡(jiǎn)便的方法[5-10]。本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫模式，建立了完整的梅花鹿茸藥材HPLC指紋特征圖譜分析，并基于主成分分析對(duì)梅花鹿茸和馬鹿茸進(jìn)行了模式識(shí)別，清晰地區(qū)分了梅花鹿茸和馬鹿茸。為梅花鹿茸藥材的品種鑒別與質(zhì)量控制提供了可靠的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀，配有四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、Chemistation化學(xué)工作站等。BP211D型十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯天平有限公司)。電熱恒溫水浴鍋(江蘇南通縣通海電器廠)。

1.2 藥材來(lái)源 10批梅花鹿茸樣品來(lái)自于我國(guó)吉林省和遼寧省的不同養(yǎng)殖場(chǎng),其中4批樣品來(lái)自于吉林雙陽(yáng)(雙陽(yáng)01，雙陽(yáng)02，雙陽(yáng)03，雙陽(yáng)04)，2批來(lái)自于吉林東豐(東豐01，東豐02)，2批來(lái)自于吉林敖東(敖東01，敖東02)，2批來(lái)自于遼寧西豐(西豐01，西豐02)。7批東馬鹿茸來(lái)自于我國(guó)東北的吉林省和遼寧省，4批來(lái)自于吉林雙陽(yáng)(雙陽(yáng)05，雙陽(yáng)06，雙陽(yáng)07，雙陽(yáng)08)，1批來(lái)自于吉林東豐(東豐03)，2批來(lái)自于遼寧西豐(西豐03，西豐04)。2批西馬鹿茸來(lái)自于我國(guó)西北的新疆省(新疆01，新疆02)。所有的樣品都得到了長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授的鑒定。甲醇(色譜純，美國(guó)TEDIA有限公司)；水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為TIANHE C18(4.6×250 mm，5 μm)。流速為0.3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫：0～5 min(B：1%～2%)；5～10 min(B：2%～2%)；10～20 min(B：2%～4%)；20～40 min(B：4%～4%)；40～42 min(B：4%～55%)；42～55 min(B：55%～60%)；55～60 min(B：60%～100%)。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷對(duì)照品適量，精密稱定,各加水制成1 mg/mL的溶液。各取尿嘧啶溶液344 μL、次黃嘌呤溶液438 μL、尿苷溶液438 μL、肌苷溶液250 μL、鳥苷溶液374 μL、腺苷溶液156 μL于同一小瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 供試品溶液的制備 依次精確稱取19分鹿茸粉末各1 g，加10 mL水煎煮1 h，然后12 000 r/min離心15 min，取1 mL上清液轉(zhuǎn)移到已經(jīng)依次用1 mL甲醇和1 mL水沖洗過(guò)的1 mL/100 mg C18固相萃取柱中，待加載完上清液后，用1 mL水洗脫固相萃取柱,洗脫液過(guò)0.45 μm濾膜，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量為5 μL，測(cè)定峰面積值,計(jì)算尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷峰面積的RSD分別為0.38%、0.42%、0.35%、0.32%、0.33%、0.40%(n=5)。試驗(yàn)表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取梅花鹿茸粉末1 g，按2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣1次，考察精密度。尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷的RSD分別為0.55%、0.58%、0.50%、0.52%、0.55%、0.58%(n=5)，結(jié)果供試品溶液中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷在24 h內(nèi)峰面積無(wú)明顯變化。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取梅花鹿茸樣品5份，每份1g，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.14，0.34，0.33，0.28，0.29，0.06 mg/g，RSD分別為2.5%、2.3%、2.6%、2.4%、2.8%、2.7%(n=5)，表明此法重復(fù)性良好。

2.4.4 回收率試驗(yàn) 取梅花鹿茸樣品適量5分，每分0.5 g，分別準(zhǔn)確加入尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷對(duì)照品0.14，0.34，0.33，0.28，0.29，0.06 g，按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷平均回收率分別為98.3%、97.5%、103.3%、97.3%、96.7%、102.2%；RSD分別為2.8%、2.7%、2.9%、2.8%、3.0%、3.3%(n=5)。試驗(yàn)表明加樣回收率良好。

2.5 梅花鹿茸HPLC指紋圖譜的構(gòu)建

2.5.1 梅花鹿茸指紋圖譜共有峰的確定 按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在2.1項(xiàng)下色譜條件下，對(duì)10批不同產(chǎn)地梅花鹿茸藥材進(jìn)行測(cè)定分析,確定了10個(gè)共有峰。其中3號(hào)峰化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，保留時(shí)間以及峰面積重復(fù)性良好,與其它相鄰峰分離良好，因此選擇3號(hào)峰為參照峰。

2.5.2 梅花鹿茸指紋圖譜共有模式建立 采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版,通過(guò)色譜峰多點(diǎn)校正的方法對(duì)10批不同產(chǎn)地梅花鹿茸藥材指紋圖譜色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配生成藥材的色譜指紋圖譜共有模式(中位數(shù)法)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

S1～S10分別是1～10號(hào)樣品，R：對(duì)照?qǐng)D譜圖1 10批梅花鹿茸樣品HPLC指紋圖譜疊加圖

2.5.3 梅花鹿茸指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 以10批不同產(chǎn)地梅花鹿茸生成的共有模式為對(duì)照,相似度分析。總體來(lái)說(shuō)，10批梅花鹿茸藥材的相似度較好，除敖東02的相似度低于0.8外，其余9批藥材的相似度均大于0.9,說(shuō)明只有敖東02的質(zhì)量較差，其他各產(chǎn)地之間指紋圖譜無(wú)明顯差異，藥材質(zhì)量穩(wěn)定可靠。

2.5.4 鹿茸藥材指紋圖譜的主成分分析 根據(jù)19批梅花鹿茸和馬鹿茸供試品溶液的HPLC譜圖給出的相關(guān)參數(shù)，比較各供試品的色譜圖。采用SPSS(20.0版)數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行PCA統(tǒng)計(jì)分析。19批鹿茸樣品的PCA分析結(jié)果顯示鹿茸樣品被清晰地分成了3組，分別命名為組Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。10批梅花鹿茸樣品聚集在組Ⅰ，7批東馬鹿茸樣品聚集在組Ⅱ，2批西馬鹿茸樣品聚集在組Ⅲ。同時(shí)，三組之間的距離也得到了清楚的分析，圖中第二組和第三組相距較近，均與第一組距離較遠(yuǎn)。由此得出結(jié)論，聚集在同一組的鹿茸樣品具有相似的化學(xué)成分分布，來(lái)源于相同起源的藥用動(dòng)物。以上結(jié)果表明指紋圖譜是和物質(zhì)的來(lái)源密切相關(guān)的，可以用來(lái)作為檢測(cè)鹿茸品質(zhì)的方法。

3 結(jié)論

鹿茸藥材中含有多種化學(xué)成分，簡(jiǎn)單測(cè)定一個(gè)或幾個(gè)有效成分的量已不能全面地反映藥材的質(zhì)量，因此建立全面，系統(tǒng)，特征性的指紋圖譜，是質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制的有效方法。本文通過(guò)建立不同產(chǎn)地的10批梅花鹿茸藥材的HPLC指紋圖譜，確立了10個(gè)共有峰。并對(duì)19批梅花鹿茸藥材和馬鹿茸藥材進(jìn)行了模式識(shí)別，采用主成分分析方法清楚的將其分為3組,梅花鹿茸單獨(dú)在一起，東馬鹿茸和西馬鹿茸離得比較近，但他們之間也能明顯的分開(kāi)。所建立的HPLC指紋圖譜及主成分分析模式方法具有快速穩(wěn)定的特點(diǎn)，能夠?qū)Σ煌a(chǎn)地的梅花鹿茸藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，也為其他動(dòng)物來(lái)源藥材的品種鑒別與質(zhì)量控制方法的研究提供參考。

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