江 剛， 張衛(wèi)東

(湖南省人民醫(yī)院呼吸內科，湖南 長沙 410005)

氧化應激機制是引起慢性阻塞性肺疾病(chro-nic obstructive pulmonary disease，COPD)的主要發(fā)病機制之一。香煙煙霧中含有大量的氧自由基和活性氧，引起細胞內氧化/抗氧化失衡，吸煙是引起COPD的主要危險因素。紅系衍生的核因子相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)是細胞內抗氧化應激的關鍵轉錄因子，是氧化還原反應感受器，在氧化應激狀態(tài)下調節(jié)抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶如谷氨酰半胱氨酸合成酶、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)的表達，避免細胞損傷[1-3]。HO-1是血紅素代謝的限速酶,具有抗氧化損傷、抗炎癥反應及細胞保護效應。近來研究表明，蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)信號通路參與Nrf2激活及其對抗氧化基因的調節(jié)，其是否參與香煙煙霧誘導的HO-1表達尚待進一步研究[4-5]。本實驗通過香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract, CSE)誘導大鼠氣道上皮細胞產生氧化應激，使用PKC抑制劑及Nrf2 siRNA，觀察Nrf2、PKC和HO-1蛋白的表達情況，以及Nrf2的核轉位變化，進一步探討PKC-Nrf2-HO-1通路在大鼠氣道上皮細胞抗氧化應激機制中的作用，及其在 COPD中可能參與的機制。

材 料 和 方 法

1 材料與動物

白沙牌香煙(湖南白沙卷煙廠)；胎牛血清(天津灝陽)；細菌蛋白酶ⅩⅣ(Sigma)；蛋白提取液(Pierce);異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)偶聯(lián)的抗大鼠抗體和FITC偶聯(lián)的抗兔抗體(北京中杉金橋)；p-PKC抗體(Cell Signaling)；RO318220、HO-1抗體和Nrf2多克隆抗體(Santa Cruz)；熒光顯微鏡(IX-70型，Olympus；中南大學湘雅醫(yī)院中心實驗室)；凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海Tanon Gis-2010)；病理圖文分析系統(tǒng)PAS9000(無錫朗珈生物醫(yī)學工程有限公司)。

雄性清潔級SD大鼠25只，體重180～200 g，由中南大學湘雅醫(yī)院動物實驗部提供。

2 方法

2.1SD大鼠氣道上皮細胞原代培養(yǎng)及分組 參照Wu等[6]方法，將雄性SD大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，分離氣管，D-Hanks液反復沖洗其內膜面，在管腔內注滿150 mg/L的細菌蛋白酶ⅩⅣ，結扎兩端后4 ℃冰箱過夜；取出氣管，剪開氣管兩端，用含20 %胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基沖洗氣管內膜面，收集細胞懸液，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用上述培養(yǎng)基重懸細胞，待氣道上皮細胞80%融合時，分別取1×106個細胞用于實驗，每次實驗重復5次。

2.2細胞分組 將25只SD大鼠的氣道上皮細胞隨機分為對照組、CSE 3 h組、PKC抑制劑RO318220組、Nrf2 siRNA組和Nrf2 siRNA+RO318220組，每組5只。CSE 3 h組為含10%CSE的DMEM/F12培養(yǎng)基共培養(yǎng)3 h；PKC抑制劑RO318220組則加入CSE前0.5 h加入3 μmol/L RO318220抑制劑；Nrf2 siRNA組為加入CSE前加入Nrf2 siRNA；Nrf2 siRNA+RO318220組為加入CSE前加入3 μmol/L RO318220抑制劑及Nrf2 siRNA。

2.3CSE的制備 參照Vayssier-Taussat等[7]方法，將白沙牌香煙點燃，其過濾嘴端接1根橡皮管，橡皮管的另一端接注射器。點燃香煙，模擬人實際吸煙狀況，每分鐘吸1次，每次30 mL，持續(xù)2 s，共收集10管300 mL煙霧，注入含10 mL DMEM玻璃瓶中，搖動玻璃瓶使煙霧充分溶解制成懸液。懸液用1 mol/L NaOH調至pH 7.4，經0.22 μm 濾膜過濾后稀釋10倍制成含10% CSE及10%胎牛血清培養(yǎng)基。制備的CSE在30 min內用于實驗。

2.4siRNA轉染 Nrf2的siRNA序列由上海吉瑪生物(Genepharma)合成，Nrf2 siRNA正義鏈5’-AGAUUUAGAUCAUUUGAAATT-3’，反義鏈5’-UUUCAAAUGAUCUAAAUCUTG-3’；陰性對照siRNA正義鏈5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。取1×105氣道上皮細胞接種在6孔板上，待細胞匯合達到80%進行實驗。用250 μL Opti-MEM? I分別稀釋5 μL LipofectamineTM2000和7.5 μL siRNA，輕輕混勻并孵育5 min，然后混合稀釋的siRNA和LipofectamineTM2000，輕輕混合并孵育20 min，將siRNA - LipofectamineTM2000復合物加入到每一個包含細胞和培養(yǎng)基的孔中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24～48 h進行轉染，使轉染效率達到70%以上。

2.5免疫細胞化學染色 采用鏈霉親和素蛋白-過氧化物酶法,按以下步驟進行：將爬有SD大鼠氣道上皮細胞的蓋玻片經常規(guī)4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100穿透細胞，3% H2O2處理封閉內源性過氧化氫酶活性，加正常山羊血清消除非特異性反應，然后滴加Ⅰ抗，加生物素化Ⅱ抗，加鏈霉親和素和3，3’-二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片、觀察，陽性結果呈棕黃色。陰性對照片以PBS代替Ⅰ抗進行孵育。結果觀察：各組隨機取5個視野，計算機自動測量并計算陽性信號積分吸光度(IA)值, 取平均值作為各實驗組陽性表達的相對強度。

2.6細胞免疫熒光染色 Ⅰ抗為兔抗大鼠Nrf2多克隆抗體，Ⅱ抗為FITC標記的抗兔抗體，操作步驟同免疫細胞化學，熒光顯微鏡下觀察熒光的表達部位。

2.7Western blotting檢測 PBS漂洗細胞2次，刮下細胞至1.5 mL EP管中，按Pierce蛋白提取液操作說明書提取胞漿蛋白和核蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。樣品分裝，貯存-80 ℃待用。每份樣本上樣200 μg，經恒壓SDS-PAGE，用半干法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，0.65 mA/cm恒流電泳，室溫，2.5 h,室溫封閉3 h后，按0.1 mL/cm膜面積加入1∶1 000 稀釋的Ⅰ抗雜交，4 ℃過夜,封閉液漂洗后按0.1 mL/cm膜面積加入1∶2 000 稀釋的Ⅱ抗，室溫下?lián)u床孵育1 h，用增強化學發(fā)光法發(fā)光，X線膠片顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)對所得條帶吸光度半定量，計算待測條帶的吸光度與內參照吸光度比值。

2.8RT-PCR檢測 采用Trizol、氯仿/異丙醇法提取細胞中總RNA，按逆轉錄試劑盒說明操作，逆轉錄成cDNA后進行PCR擴增。大鼠HO-1上游引物5’-CTTTCAGAAGGGTCAGGTGTCCA-3’，下游引物5’-CTGAGAGGTCACCCAGGTAGCGG-3’，擴增產物為309 bp。PCR反應條件為94 ℃30 s，63 ℃30 s，72 ℃ 60 s，32個循環(huán)。以GAPDH為內參照，其上游引物5’-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’,下游引物5’-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3’，擴增產物為450 bp。取8 μL 擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，用Bio-Rad Gel Doc 2000型凝膠圖像分析系統(tǒng)進行掃描分析，所測擴增條帶積分光密度值用內參照修正。

2.9HO-1活性測定 根據HO-1降解血紅素生成膽紅素和一氧化碳的原理，測定樣品反應物中膽紅素生成量可代表HO-l的活性[8]。取1×106個細胞,用含20 mmol/L Tris-HCl和Triton X-100緩沖液漂洗，然后4 ℃、15 000×g離心15 min，收集上清液，加入含2 mmol/L MgCl2、2.75 mmol/L NADPH、1×103U/L肝膽綠素還原酶和1 mmol/L正鐵血紅素200 μL中，置37 ℃暗處1 h，之后加入氯仿1 mL 終止反應。以不含NADPH的樣品作空白對照，樣品與空白均做雙份，在分光光度計上用400 nm和650 nm雙波長測定膽紅素生成量。

3 統(tǒng)計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理,多個樣本比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 細胞免疫熒光觀察Nrf2蛋白的表達位置

細胞免疫熒光顯示在正常對照組Nrf2蛋白主要分布在大鼠氣道上皮細胞胞漿中。在CSE 3 h組，Nrf2蛋白集中分布在氣道上皮細胞胞核中，其表達明顯增強，提示Nrf2蛋白由胞漿向胞核轉位。當預先給予PKC抑制劑RO318220，Nrf2蛋白主要位于大鼠氣道上皮細胞胞漿，而胞核未見明顯顯現(xiàn)，提示RO318220抑制Nrf2蛋白核轉位，見圖1。

Figure 1. The protein expression of Nrf2 in the rat airway epithelial cells detected by immunofluorescence. A: control group (×200); B: CSE 3 h group (×200); C: RO318220 group (×100).

2 Western blotting檢測各組PKC、HO-1和Nrf2蛋白的表達

Western blotting法檢測結果顯示Nrf2胞漿蛋白在對照組和RO318220組表達增強，在CSE 3 h組、RO318220抑制劑組、Nrf2 siRNA組及Nrf2 siRNA+RO318220組表達均明顯減弱(P<0.05)。Nrf2胞核蛋白和HO-1蛋白在CSE 3 h組表達明顯強于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在RO318220組、Nrf2 siRNA組及Nrf2 siRNA+RO318220組表達均減弱，各組間比較差異無統(tǒng)計學意義，與對照組相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。p-PKC蛋白在CSE 3 h組和Nrf2 siRNA組較對照組表達均明顯增強(P<0.05)，在RO318220組和Nrf2 siRNA+RO318220組表達降低，與對照組比較均無顯著差異(P>0.05),見圖2。

Figure 2. The protein expression of nuclear Nrf2, cytoplasmic Nrf2, HO-1 and p-PKC in the rat airway epithelial cells determined by Western blotting. The corresponding β-actin was showed as the loading control.Mean±SD.n=5.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs CSE 3 h group.

3 免疫細胞化學觀察各組HO-1蛋白的變化

HO-1蛋白主要表達在大鼠氣道上皮細胞胞漿中，在對照組其胞漿弱陽性表達，在CSE 3 h組其胞漿呈強陽性表達；在RO318220組、Nrf2 siRNA組和RO318220+Nrf2 siRNA組其胞漿弱陽性表達，與CSE 3 h組比較差異顯著(P<0.05)，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

Figure 3. The protein expression of HO-1 in the rat airway epithelial cells detected by immunocytochemistry (×200). A: control group; B: CSE 3 h group; C: Nrf2 siRNA group; D: RO318220 group; E: RO318220+Nrf2 siRNA group.

4 RT-PCR檢測各組HO-1 mRNA表達水平

HO-1 mRNA水平在CSE 3 h組明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在RO318220組、Nrf2 siRNA組及RO318220+Nrf2 siRNA組HO-1 mRNA均低表達，與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但明顯低于CSE 3 h組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The mRNA expression of HO-1 in the rat airway epithelial cells determined by RT-PCR. The correspon-ding GAPDH was showed as the loading control.Mean±SD.n=5. *P<0.05 vs control group.

5 各組HO-1活性

HO-1活性在CSE 3 h組為(2.34±0.16) nmol·(g protein)-1·h-1，明顯高于對照組(0.75±0.07)nmol·(g protein)-1·h-1。在RO318220組、Nrf2 siRNA組和Nrf2 siRNA+RO318220組，HO-1活性分別下降到(0.78±0.07)、(0.82±0.10)和(0.76±0.07)nmol·(g protein)-1·h-1，明顯低于CSE 3 h組(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

討 論

HO-1是血紅素代謝的限速酶，催化血紅素分解為一氧化碳、鐵和膽綠素。HO-1位于非神經組織中，具有抗氧化損傷、抗炎癥反應和細胞保護效應，在氧化應激、硝化應激、巰基化物質及細胞因子等作用下誘導表達。香煙煙霧中含有大量的自由基和活性氧，通過氧化應激引起肺損傷，而氣道上皮細胞和肺泡細胞內抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶如HO-1過表達以對抗損傷。研究證明槲皮素增加HO-1表達，避免過氧化氫誘導的肺上皮細胞損傷[9]。本研究表明，大鼠氣道上皮細胞暴露CSE 3 h后，HO-1蛋白在大鼠氣道上皮細胞胞漿中表達明顯增強，HO-1 mRNA及蛋白表達水平上調，HO-1活性增強,說明CSE通過氧化應激上調大鼠氣道上皮細胞HO-1表達。

Nrf2屬于bZIP轉錄因子，具有保護細胞避免內源性及外源性應激。Keap1是Nrf2的主要抑制因子，和Nrf2構成氧化應激的關鍵感受器，在氧化應激時通過與抗氧化基因如谷氨酰半胱氨酸合成酶、HO-1、醌氧化酶1等基因的抗氧化反應元件(antioxidant response element, ARE)結合，調節(jié)抗氧化基因的表達。近來研究發(fā)現(xiàn)，HO-1誘導劑姜黃素通過Nrf2與HO-1的ARE結合，上調HO-1表達。甘菊通過提高Nrf2磷酸化水平和核轉位，與HO-1的ARE結合,提高HO-1表達水平[10]。同型半胱氨酸通過Nrf2調節(jié)HepG2細胞HO-1表達[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠氣道上皮細胞暴露CSE 3 h后，Nrf2蛋白由胞漿向胞核轉位，其胞核蛋白表達明顯增強，胞漿蛋白明顯降低，HO-1活性、mRNA和蛋白水平明顯升高。然而，使用siRNA敲除Nrf2，明顯抑制了Nrf2胞漿和胞核蛋白表達，而且顯著抑制了HO-1活性、mRNA和蛋白水平。這表明Nrf2的激活及其核轉位在CSE調節(jié)H抗氧化基因O-1的表達中具有非常重要作用。

研究表明絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和PKC信號通路參與激活Nrf2，引起Nrf2核轉位，調節(jié)抗氧化基因的表達[1, 4, 6]。PKC信號通路通過磷酸化Nrf2 (Ser40)，使Nrf2與Keap1分離，從而調節(jié)抗氧化基因表達。Zhang等[12]對離體兔心臟缺血再灌注的研究中發(fā)現(xiàn)，PKC誘導Nrf2的核轉位，增強HO-1的抗氧化防御能力。Quesada等[13]研究表明力生長因子24參與激活PKCε-Nrf2，上調HO-1表達，保護SH-SY5Y細胞避免6-羥多巴胺引起的細胞凋亡。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，當大鼠氣道上皮細胞暴露CSE 3 h后，PKC蛋白表達增強，Nrf2蛋白出現(xiàn)核轉位，HO-1活性、mRNA及蛋白表達均明顯增強。然而，預先加入RO318220，抑制Nrf2核轉位，其胞漿蛋白水平增強，胞核蛋白水平減弱，且HO-1活性明顯降低，其mRNA及蛋白表達明顯減弱。預先給予Nrf2 siRNA，Nrf2胞漿和胞核蛋白、HO-1活性、mRNA及蛋白表達水平均顯著降低，而PKC蛋白表達增強。同時加入RO318220和Nrf2 siRNA，PKC蛋白和HO-1活性、mRNA及蛋白表達均明顯降低。這表明PKC參與Nrf2核轉位及HO-1上調表達。然而，Lee等[14]對人臍靜脈上皮細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，非瑟酮通過PKC-δ和p38 MAPK信號通路激活Nrf2活性，引起Nrf2核轉位，與HO-1的ARE結合,上調HO-1表達,從而對抗過氧化氫誘導的氧化應激。鵝掌菜酚通過ERK和 PI3K/Akt信號通路激活Nrf2，上調HO-1表達，降低氧化應激對中國地鼠肺纖維細胞的損傷[15]。這表明誘導HO-1表達的信號通路在不同誘導劑和不同細胞種類之間具有差異。所以，PI3K/Akt和MAPK是否參與香煙煙霧誘導的Nrf2核轉位和HO-1表達仍需進一步研究。

本研究證明CSE引起大鼠氣道上皮細胞產生氧化應激；通過PKC信號通路激活Nrf2，誘導Nrf2核轉位，上調HO-1表達，可維持細胞內氧化/抗氧化平衡。因此，對PKC-Nrf2-HO-1信號通路的進一步研究有助于更加深入了解COPD氧化/抗氧化發(fā)病機制，為尋找一種新的調節(jié)Nrf2抗氧化藥物在COPD治療中提供理論研究基礎。

[參 考 文 獻]

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