何 平， 李 丹， 李德天， 馮國和

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院 1腎內科， 2感染科, 遼寧 沈陽 110004)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是全球范圍內重要的公共衛(wèi)生問題之一。據估計全球范圍內約有3.5億人是慢性HBV攜帶者[1]。長期以來中國、東南亞和熱帶非洲為高流行區(qū)。自1971年Combes等首先描述了第1例具有持續(xù)HBsAg血癥的患者發(fā)生了膜性腎病以來，腎小球腎炎已被公認為是HBV感染引起的最常見肝外病變，又稱乙型病毒肝炎相關性腎炎(HBV-associated glomerulonephritis，HBVGN)。既往認為，HBVGN的發(fā)病機制是HBV抗原和抗體形成的循環(huán)免疫復合物和原位免疫復合物在腎組織的沉積。但目前認為，HBV因其泛嗜性而直接感染腎組織細胞，產生病毒殺細胞效應，也是HBVGN重要的發(fā)病機制之一[2]。

HBV X蛋白(HBV X protein,HBx)基因是HBV基因組中最小的開放性讀碼框，編碼長度為154個氨基酸的蛋白。X蛋白是一種多功能蛋白，能夠激活多種細胞的信號轉導通路，調節(jié)凋亡等。然而，針對不同種類的細胞及不同的外界條件，HBx調節(jié)細胞凋亡的作用及機制也各不相同[3]。大量研究表明HBx可以激活JAK/STAT、Ras-Raf-MAPK、p38 MAPK、JNK、PI3K、Src酪氨酸激酶、Pyk-2等信號通路[4-5],誘導宿主細胞凋亡[6-8]。

細胞凋亡是基因控制和酶促反應下按一定程序進行的細胞主動性死亡。天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)是凋亡產生的最終效應酶。凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax位于caspase-3的上游，Bax和Bcl-2二者的表達水平及Bcl-2/Bax比值是影響細胞生存的重要因素[9-11]。而Bcl-2和Bax的表達又受到JAK/STAT信號通路的調控[12]。JAK/STAT信號通路是一條重要的細胞因子信號轉導通路，與細胞的增殖、分化、凋亡等密切相關。JAK是內源性蛋白酪氨酸激酶，它可在細胞因子受體與相應配基結合后活化，進而使胞漿中的STAT分子磷酸化，2個磷酸化的STAT分子形成二聚體進入細胞核，在核內它們與靶基因啟動子中特異的DNA序列結合而誘導目的基因表達。研究表明，多種急、慢性腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展都與細胞凋亡有著密切關系[13-16]。既往在針對HBVGN腎組織的研究中發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡的主要發(fā)生部位是近端及遠端腎小管上皮細胞，腎小球少見，同時凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2比值也發(fā)生了相應的變化；但JAK/STAT信號通路的活化情況及其在凋亡中的作用并不清楚[17-19]。為了進一步明確HBVGN中HBx的致病機制及JAK/STAT信號通路的活化在腎小管上皮細胞凋亡中的作用，我們將HBx基因真核表達載體轉染至人腎近曲小管上皮細胞(HK-2細胞)中，檢測JAK/STAT信號通路的激活及對HK-2細胞增殖和凋亡的影響，為HBVGN發(fā)病機制的研究提供新的實驗依據。

材 料 和 方 法

1 細胞培養(yǎng)和分組

HK-2細胞購自北京中原公司(ATCC中國大陸總代理)。用Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基在37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞呈單層貼壁生長，實驗均取對數生長期細胞。待細胞長滿培養(yǎng)瓶瓶底(一般2～3 d)后，無菌條件下用0.25%胰酶消化傳代。

實驗分兩部分。第一部分實驗分5組: (1)對照組，(2)轉染空質粒pcDNA3.1(+)組(空質粒組)，(3)轉染質粒pcDNA3.1(+)-HBx 24 h組(HBx 24 h組)，(4)轉染質粒pcDNA3.1(+)-HBx 48 h組(HBx 48 h組)和(5)轉染質粒pc-DNA3.1(+)HBx 72 h組(HBx 72 h組)。第二部分實驗分6組: (1)對照組，(2)轉染空質粒pcDNA3.1(+)組，(3)轉染質粒pcDNA3.1(+)-HBx組，(4)對照組+AG490組，(5)轉染空質粒pcDNA3.1(+)+AG490組，(6)轉染質粒pcDNA3.1(+)-HBx +AG490組,其中(4)～(6)組的細胞用AG490(Sigma)孵育24 h。

2 主要方法

2.1質粒轉染 用Lipofectamine? LTX & Plus轉染試劑(Invitrogen)，按照說明書步驟進行轉染。在實驗中，用與pcDNA3.1(+)-HBx大小接近的pEGFP-C1熒光質粒(Clontech)共轉染，間接評估目的質粒轉染效率。

2.2Western blotting法檢測目標蛋白 收獲細胞后，用含有PMSF的RIPA裂解液提取細胞總蛋白。細胞提取物用BCA法測定濃度。等量上樣，用8%及12% SDS-PAGE分離。之后將蛋白轉移至PVDF膜上。封閉后，分別加入 Ⅰ 抗：HBx(1∶1 000，Chemicon)、JAK2(1∶2 000，CST)、p-JAK2(1∶1 500，CST)、STAT3(1∶1 000，CST)和p-STAT(1∶2 000，CST)，4 ℃搖床孵育過夜。加入相應Ⅱ抗，進行ECL反應。一次性完成定影、顯影及圖像分析系統(tǒng)測定條帶的灰度值。

2.3熒光顯微鏡和透射電鏡觀察細胞凋亡 通過Hoechst 33342(Sigma)對細胞核染色觀察凋亡細胞的形態(tài)學變化。HK-2細胞以5×105的密度接種于6孔板中爬片過夜, 分別轉染空質粒pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)-HBx，并設對照組。分別于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。取出細胞爬片，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS再洗3次，加入Hoechst 33342熒光染料(5 mg/L)37 ℃避光孵育8 min，再用PBS洗3次。盡快于熒光顯微鏡下觀察、照相。

應用透射電鏡觀察HK-2細胞的超微結構。細胞以5×105的密度接種于6孔板中過夜，分別轉染空質粒pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)-HBx，并設對照組。分別于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。后胰酶消化，收集細胞，置于2.5%戊二醛(4 ℃保存)中固定。固定后的組織經0.1 mol/L磷酸緩沖液中充分漂洗，用1%鋨酸(OsO4)雙固定24 h，漂洗后乙醇梯度脫水，丙酮置換、浸透，環(huán)氧樹脂Epon812浸透、包埋、聚合，LKB超薄切片機制成超薄切片，于透射電鏡下觀察腎小管上皮細胞超微結構。

2.4Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率 Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒購自中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。HK-2細胞以5×108/L接種于6孔板中培養(yǎng)24 h貼壁后, 分別轉染空質粒pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)-HBx，并設對照組。分別于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。用無EDTA胰酶消化收集細胞。離心、PBS洗滌細胞3次。用500 μL 1× binding buffer懸浮細胞，濃度大約為1×109/L。在細胞懸浮液中加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，4 ℃冰箱避光孵育30 min。加入5 μL PI后輕輕混勻，4 ℃避光孵育5 min。隨即用流式細胞儀檢測(最遲1 h內)。結果用CellQuest專業(yè)軟件獲取分析數據。Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術可將實驗樣本中正常、壞死和凋亡細胞區(qū)分開。以FITC和PI熒光作雙參數點圖，細胞分為4個象限，左下象限為 Annexin V-FITC-、PI-,代表正?；罴毎?；左上象限為 Annexin V-FITC-、PI+,代表機械損傷細胞；右下象限為Annexin V-FITC+、PI-,代表早期凋亡細胞；右上象限為Annexin V-FITC+、PI+,代表晚期凋亡/壞死細胞。分別計數各組細胞凋亡率并進行組間比較。實驗重復3次。

2.5細胞增殖的測定 CCK-8(中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)法檢測HBx對HK-2細胞增殖的作用：消化收集對數增殖期細胞并調整成濃度為1×108/L的細胞懸液，接種于3張96孔板，每孔100 μL。接種過夜后,鏡下觀察確認細胞貼壁良好。細胞分3組：分別為對照組、轉染空質粒組和轉染pcDNA3.1(+)-HBx組。實驗設不加細胞只有全培養(yǎng)基的空白對照，比色時以空白對照校零。細胞在37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。結束培養(yǎng)前2 h每孔加CCK-8 10 μL。于450 nm波長處檢測每孔吸光度值(A值)。實驗重復3次。細胞生存率及增殖抑制率按如 下公式計算：生存率(%)=(實驗組A值/對照組A值)×100%;抑制率(%)=(1-生存率)×100%。

2.6免疫熒光觀察 各組細胞在蓋玻片上生長融合到95%～100%時，從孵箱中取出；用PBS洗后，4%甲醛固定;0.5%Triton X-100在37 ℃溫箱透化20 min;血清封閉后，分別加Ⅰ抗STAT3(1∶50)和p-STAT3(1∶100),濕盒里4 ℃過夜;加Ⅱ抗后，DAPI復染，95%甘油封片;共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照。

3 統(tǒng)計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)；相關分析采用直線相關。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

和地下潛流，它劈開群山峻嶺，奔涌不息，橫穿祁連山脈，在這里留下了一條大峽谷——黑河大峽谷，其原始神奇的峽谷風光正等待著大家前去游覽、欣賞。

結 果

1 目的質粒pcDNA3.1(+)-HBx的轉染效率及HBx在HK-2細胞中的表達

利用共聚焦顯微鏡觀察到pcDNA3.1(+)-HBx的轉染效率大概在45%～55%左右，見圖1。轉染pcDNA3.1(+)HBx 24 h、48 h及72 h組在17 kD出現(xiàn)一條明顯條帶,表明HBx在HK-2細胞有陽性表達。轉染目的基因24 h及48 h，蛋白表達量無明顯區(qū)別(P>0.05)。轉染目的基因72 h后，蛋白表達水平最高，與24 h、48 h比較，差異顯著(P<0.05)?？召|粒轉染及未轉染組未見相應蛋白條帶，見圖2A。

Figure 1. Plasmid transfection efficiency in HK-2 cells observed under confocal microscope (×100). A: fluorescence microscopy; B:confocal microscopy.

對照組、空質粒組及pcDNA3.1(+)-HBx組轉染24 h后，加用AG490再孵育24 h。轉染質粒pc-DNA3.1(+)-HBx組及轉染質粒pcDNA3.1(+)-HBx+AG490組均有HBx表達，且表達量無明顯差異(P>0.05)，見圖2B。這說明AG490不影響HBx蛋白的表達。

2 倒置顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)變化

對照組細胞及轉染空質粒組細胞密度較大，形態(tài)基本正常；而轉染pcDNA3.1(+)-HBx后各時點各組出現(xiàn)細胞增殖受抑，細胞密度變小，凋亡細胞的體積變小、變圓；細胞出現(xiàn)皺縮、脫落，見圖3。

Figure 2. Protein expression of HBx in HK-2 cells at different time points after transfection (A) and in the presence or absence of AG490 (B) detected by Western blotting. Mean±SD. n=5. #P<0.05, ##P<0.01 vs control.

Figure 3. Morphological changes of the HK-2 cells with different treatments observed under inverted microscope (×100).

3 轉染目的基因HBx后，p-JAK2及p-STAT3水平明顯增高；加用AG490后，p-JAK2及p-STAT3水平較前明顯下降

Western blotting分析顯示對照組細胞中JAK2和STAT3均有表達，且JAK2及STAT3有少量磷酸化，轉染空質粒組與對照組無明顯差異(P>0.05)。轉染pcDNA3.1(+)-HBx 后24 h，p-JAK2及p-STAT3的表達均明顯增高，至轉染72 h達到高峰；轉染pc-DNA3.1(+)-HBx后各組間及與對照組間均有顯著差異(P<0.05)。JAK2及STAT3在轉染后24 h表達也明顯增高，隨著轉染時間延長，蛋白表達呈現(xiàn)逐漸增強趨勢，轉染72 h，達到高峰。各組間及與對照組比較，均有顯著差異(P<0.05)，見圖4。

細胞免疫熒光觀察結果顯示STAT3和 p-STAT3 2種信號蛋白在各組腎小管上皮細胞均有表達。在對照組中STAT3和p-STAT3 蛋白均主要表達于胞漿，且p-STAT3 蛋白表達很弱；轉染pcDNA3.1(+)-HBx后各組p-STAT3 蛋白水平均明顯增加，并且隨時間延長表達增強；在 72 h 時表達水平最高，在胞漿及胞核均有較高表達。轉染pcDNA3.1(+)-HBx 24 h后，STAT3蛋白水平亦明顯增加，并且隨時間延長表達增強，在72 h達高峰，主要在胞漿表達，見圖5、6。

Figure 4. The protein expression of JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 in HK-2 cells at different time points after transfection with HBx (detected by Western blotting). Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control.

Figure 5. Immunofluorescence observation of p-STAT3 expression in HK-2 cells at different time points after transfection with HBx (×400).

加用AG490孵育后(HBx 48 h+AG490組)，與未加入組(HBx 48 h組)相比， p-JAK2、p-STAT3、JAK2及STAT3的表達均有所下降(P<0.05)。而對照組、轉染空質粒組、對照組+AG490組及轉染空質粒+AG490組上述4種信號蛋白的表達無明顯差異(P>0.05)，見圖7。

4 轉染目的基因HBx對HK-2細胞增殖的作用

設對照組細胞生存率為100%。轉染空質粒組細胞生存率與對照組無明顯差別(P>0.05)，提示對細胞無明顯增殖抑制作用。轉染pcDNA3.1(+)-HBx 24 h 后，細胞生存率明顯下降，提示HBx對細胞增殖有抑制作用，抑制率為(14.08±2.14)%，與對照組相比，差異顯著(P<0.05)。轉染pcDNA3.1-(+)HBx 48 h 后，細胞的增殖抑制率顯著增加，達到(31.33±2.24)%，與對照組和轉染pcDNA3.1(+)-HBx 24 h組比較，差異顯著(P<0.05)。轉染72 h后，細胞的增殖抑制率達到(35.27%±1.10)%，與對照組和轉染pcDNA3.1(+)-HBx 24 h組比較，差異顯著(P<0.05)；但與轉染48 h組比較無明顯差異(P>0.05)，見圖8。

Figure 6. Immunofluorescence observation of STAT3 expression in HK-2 cells at different time points after transfection with HBx (×400).

5 轉染目的基因HBx引起腎小管上皮細胞凋亡

應用Hoechst 33342染色、透射電鏡及流式細胞術等方法檢測轉染pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)-HBx后HK-2細胞的凋亡。圖9顯示，應用透射電鏡觀察各組細胞的超微結構。對照組及轉染空質粒組的細胞核近于圓形，核仁偏位存在，核膜清晰，胞質內有大量核糖體，線粒體和一些粗面內質網，細胞表面見有微絨毛。轉染目的基因HBx后24 h組、48 h組和72 h組可見核仁不規(guī)則，有凹陷，核膜水腫，核內異染色質凝聚、邊集。凋亡晚期有核膜溶解，核碎裂。應用Hoechst 33342染色觀察各組細胞轉染后凋亡形態(tài)學改變，見圖10A。對照組及轉染空質粒的HK-2細胞核輪廓清晰，細胞核正常，可見核分裂。pcDNA3.1(+)-HBx 轉染24 h組、48 h組和72 h組HK-2可見核碎裂、固縮，部分核溶解，染色質邊集等，并且隨著轉染時間延長，細胞數量明顯減少，細胞核改變加重。圖10A中的白色橢圓形圈出典型的凋亡核改變，其放大圖像見圖10B。

流式細胞術結果顯示，對照組HK-2細胞的凋亡率為 (5.81±1.62)%；轉染空質粒組細胞的凋亡率為 (5.92±1.09)%；轉染pcDNA3.1(+)-HBx 24 h組細胞的凋亡率為(15.18±1.98)%；轉染pcDNA3.1(+)-HBx 48 h組細胞的凋亡率為(20.62±2.23)%；轉染pcDNA3.1(+)-HBx 72 h組細胞的凋亡率為 (23.83±2.16)%。轉染空質粒組凋亡率較對照組無明顯變化。轉染pcDNA3.1(+)-HBx 24 h后細胞的凋亡率較對照組顯著增高，差異顯著(P<0.05)。其中，轉染48 h組較轉染24 h組凋亡率顯著增高，差異顯著(P<0.05)。但轉染后48 h與轉染后72 h無顯著差異(P>0.05)，見圖11。

Figure 7. The effects of AG490 on the protein expression of JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 in HK-2 cells at 48 h after transfection with HBx. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control.

圖12顯示，對照組細胞的凋亡率為(8.62±1.58)%；轉染空質粒組細胞的凋亡率為(8.34±1.25)%；對照組+AG490組細胞的凋亡率為(6.30±2.01)%；轉染空質粒組+AG490組細胞的凋亡率為(7.39±1.74)%；對照組及轉染空質粒組加與不加AG490凋亡率無明顯差異(P>0.05)。轉染pcDNA3.1(+)HBx 48 h后細胞的凋亡率顯著增加，為(23.85±1.42)%；加用AG490孵育后細胞凋亡率顯著下降為(14.34±2.63)%，但與對照組相比凋亡率仍明顯增高，均有顯著差異(P<0.05)。

Figure 8. Effect of HBx gene transfection on the viability of HK-2 cells. Mean±SD. n=5. #P<0.05 vs control.

Figure 9. Ultrastructural changes of the HK-2 cells at different time points after transfection with HBx observed under transmission electronic microscope (×4 000).

Figure 10. Hoechst 33342 staning revealed apoptotic morphologic variations in the HK-2 cells transfected with HBx gene. A：the white ovals indicate the typical apoptotic changes of the nuclear morphology (×400)； B: image amplification of the areas in the white ovals from A. a: normal nucleus; b～h: apoptotic nuclei.

Figure 11. The apoptotic rates of the HK-2 cells at different time points after transfection with HBx gene determined by flow cytometry. Mean±SD. n=5. #P<0.05 vs control.

討 論

HBVGN已被公認為是HBV感染引起的最常見肝外病變， 其發(fā)病機制至今尚未完全闡明。近年來有較多研究報道HBV相關核酸分子在腎組織病變的關系，發(fā)現(xiàn)HBVGN患者腎臟中存在HBV-DNA，HBV-RNA 和閉合環(huán)狀雙鏈DNA(cccDNA)，甚至完整的病毒顆粒[20-22]，進一步支持了HBV可直接感染腎臟并原位復制而致病的觀點。

既往Clippinger等[3,23]利用原代培養(yǎng)肝細胞，先后研究HBx蛋白在線粒體的定位及對肝細胞凋亡的影響。結果發(fā)現(xiàn)，在肝細胞中，HBx既能抗凋亡又能刺激凋亡，主要是根據NF-κB信號通路的狀態(tài)。但針對腎小管上皮細胞，HBx蛋白與腎小管上皮細胞凋亡之間的關系及其信號通路迄今為止尚未明確。

Figure 12. The effect of AG490 on the cell apoptotic rates in the HK-2 cells tranfected with HBx gene. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control.

凋亡是由體內外因素觸發(fā)細胞內預存的死亡程序而導致的細胞程序性死亡，是從細胞外信號短-細胞內信號通路短-凋亡相關基因和酶作用的復雜過程[25]。各種細胞外因素對細胞行為的調節(jié)主要與細胞內多種信號轉導通路的活化密切相關，其中JAK/STAT途徑近年來倍受關注。JAK/STAT信號途徑是細胞因子轉導的重要通路之一，對細胞的生理和病理反應發(fā)揮著重要的調控作用[25]。

為了驗證JAK2/STAT3信號通路活化與HBx蛋白之間的關系，我們將HBx基因轉染至體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞(HK2細胞株)中，應用免疫細胞化學及Western blotting方法檢測JAK2/STAT3信號通路活化。結果顯示，在體外，HBx可以增加p-STAT3表達，活化JAK2/STAT3信號通路。進一步驗證了JAK2/STAT3信號通路活化參與了HBVGN的發(fā)生發(fā)展。

Deng等[26-27]用HBV-DNA陽性血清體外培養(yǎng)人腎小管上皮細胞，可誘導其凋亡；且細胞凋亡比例與HBV的DNA水平呈正相關。不可控制的腎小管上皮細胞凋亡會引起腎臟損傷進而可能導致腎間質纖維化的發(fā)生[28]。在本研究中，質粒轉染 體外培養(yǎng)細胞實驗更深入證實了HBx能夠導致HK2細胞凋亡，且凋亡與JAK2/STAT3信號通路活化有關。最近，一些學者認為細胞的密度或者融合狀態(tài)可能會影響不同細胞的生物學行為和反應，包括細胞凋亡等[29-30]。而在本研究中，所有實驗均在細胞亞融合狀態(tài)下完成(約70%融合度)，且設置了空載體轉染對照組，所以我們得出的結果是可信的。

為了進一步證明JAK2/STAT3信號通路活化確實參與了腎小管上皮細胞的凋亡，我們在實驗中使用了JAK/STAT信號通路阻斷劑AG490。AG490是JAK2特異性抑制劑，可有效抑制JAK2酪氨酸磷酸化并且阻斷其下游的信號轉導和轉錄活化因子STAT的活化[31]。AG490處理后，HBx基因轉染所致HK-2細胞凋亡率明顯下降；與此同時，p-JAK2及p-STAT3表達水平均有所降低。這些結果說明JAK/STAT信號通路活化參與了HBV感染所致腎臟損傷中。

總之，我們的研究表明，JAK2/STAT3信號通路活化參與到HBx致腎小管上皮細胞凋亡過程中。并為HBVGN發(fā)病機制中病毒直接損傷作用提供了實驗依據。

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