勞國娟， 任 萌， 黃燕瑞， 楊 川， 王曉藝， 嚴(yán) 勵

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510120)

隨著對糖尿病皮膚病變發(fā)病機制的深入研究，我們認(rèn)識到糖尿病皮膚創(chuàng)傷難愈合的原因除與過量微生物負(fù)荷以及周圍神經(jīng)、血管病變、生長因子水平下降等因素有關(guān)外[1]，細(xì)胞凋亡在糖尿病皮膚損傷及愈合中也發(fā)揮了重要作用[2]。然而，關(guān)于糖尿病皮膚凋亡的研究目前主要涉及動物實驗，對于糖尿病患者足部傷口細(xì)胞凋亡情況，尚不清楚。此外，糖尿病病理狀態(tài)下細(xì)胞凋亡的原因和影響因素未完全闡明。研究表明，糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展與持續(xù)高糖、血糖波動、晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycosylation end products， AGEs)等因素密切相關(guān)。研究這些因素對細(xì)胞凋亡的影響有助于闡明糖尿病病理狀態(tài)下細(xì)胞凋亡和傷口難愈的機制。因此，本實驗收集糖尿病和非糖尿病足部傷口皮膚標(biāo)本，探討糖尿病患者創(chuàng)面皮膚細(xì)胞凋亡的情況，并觀察正常濃度糖、持續(xù)高糖、高糖波動和AGEs對人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響，為明確細(xì)胞凋亡在糖尿病皮膚潰瘍發(fā)生發(fā)展中的作用提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1主要試劑 兔抗人cleaved-caspase-3 (Asp175)單克隆抗體購自CST，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(streptavidin-biotin complex，SABC)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，原位缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)凋亡試劑盒購自Roche，AGEs購自Merck。

1.2皮膚標(biāo)本 糖尿病足組:自2011年6月至2013年4月于我科因糖尿病足住院的2型糖尿病患者18例；非糖尿病組：自2011年6月至2013年4月于我院骨科因足部外傷行外科手術(shù)治療住院的非糖尿病患者18例。所有皮膚標(biāo)本均在局部感染控制后取材，距離足部傷口邊緣0.5 cm。剪取皮膚標(biāo)本后以4%多聚甲醛溶液固定，制作厚度5 μm石蠟切片。所有患者簽署知情同意書。

1.3細(xì)胞來源 本院泌尿外科或小兒外科正常兒童包皮環(huán)切術(shù)后的手術(shù)標(biāo)本，均經(jīng)患者家屬同意后留取標(biāo)本，皮膚成纖維細(xì)胞進行分離、培養(yǎng)和鑒定。實驗對象取第4～6代細(xì)胞。

2 方法

2.1一般情況 詢問所有受試者病史并體檢，記錄年齡、性別、傷口持續(xù)時間，測量血壓、身高、體重，計算體重指數(shù)(body mass index，BMI)等，測量數(shù)據(jù)均重復(fù)2次，取平均值。由本院生化實驗室檢測受試者空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、餐后2 h血糖(2-hour postprandial blood glucose，2 h PBG；非糖尿病組為口服葡萄糖耐量試驗2 h血糖)、糖基化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine amino-transferases，ALT)及血清肌酐(serum creatinine，SCr)。

2.2Cleaved-caspase-3免疫組織化學(xué)染色 采用SABC法染色：切片常規(guī)脫蠟、水化。滴加3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。切片置于檸檬酸緩沖液中，微波加熱修復(fù)抗原。5% BSA封閉，滴加兔抗人的cleaved-caspase-3單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔第Ⅱ抗體。PBS沖洗，SABC孵育。DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染。切片經(jīng)過梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。染色過程中均設(shè)有陰性對照。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：免疫組化染色結(jié)果按照盲法由一位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師獨立進行判斷，細(xì)胞漿有棕色著色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，無棕色著色的為陰性細(xì)胞。染色結(jié)果按照免疫反應(yīng)評分(immunoreactive score，IRS)標(biāo)準(zhǔn)進行評分，IRS=P×I。P為陽性細(xì)胞百分比分級：沒有陽性細(xì)胞，P=0；陽性細(xì)胞占1%～24%，P=1；陽性細(xì)胞占25%～49%，P=2；陽性細(xì)胞占50%～74%，P=3；陽性細(xì)胞占75%～100%，P=4。I為染色強度：沒有染色，I=0；染色淺，I=1；染色中等強度，I=2；染色深，I=3。每個標(biāo)本隨機選取5個高倍視野評分，取平均值。

2.3TUNEL檢測 石蠟切片脫蠟、水化后，滴加蛋白酶K(proteinase K)通透細(xì)胞，加入TUNEL反應(yīng)混合液(enzyme solution∶label solution=1∶9)，保濕、避光，37 ℃孵育，滴加過氧化物酶(peroxidase，POD)轉(zhuǎn)化劑，加入底物DAB顯色，蘇木素復(fù)染。常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封固。實驗過程設(shè)有陰性對照。每個標(biāo)本隨機選取5～10個高倍視野，計數(shù)1 000個細(xì)胞，細(xì)胞核中有棕黃色者即為凋亡細(xì)胞，計算凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)，AI(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/1 000×100%。

2.4人原代皮膚成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 包皮塊在75%乙醇中浸泡1 min，用含雙抗(青霉素和鏈霉素)的D-Hanks液清洗。去除皮下組織，將組織分切為2 mm×5 mm大小皮條，加入0.2% 中性蛋白酶，4 ℃，消化過夜。分離表皮和真皮層。 真皮切成1 mm×1 mm×1 mm小塊，加入0.25%含EDTA的胰酶消化15 min，終止消化后反復(fù)吹打獲得單細(xì)胞懸液，篩網(wǎng)去除剩余殘渣，收集濾液，離心，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，置于37 ℃、5%CO2、90%濕度條件下培養(yǎng)、傳代。免疫細(xì)胞化學(xué)染色進行鑒定。

2.5Western blotting檢測 分組：正常濃度糖組(normal glucose，NG；5.6 mmol/L)、持續(xù)高糖組(sustained high glucose，HG；25 mmol/L)、高糖波動組(fluctuant high glucose，F(xiàn)HG；5.6 mmol/L與25 mmol/L 交替，8 h換液)和AGEs組(AGEs 150 mg/L)。人皮膚成纖維細(xì)胞按1×104cells/well的密度接種至6孔板。細(xì)胞長至對數(shù)生長期60%融合，饑餓細(xì)胞24 h，使細(xì)胞進入同步化狀態(tài)。按實驗分組更換目的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞，提取總蛋白，MiniBCA法測定蛋白質(zhì)濃度，蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，依次加入兔抗人cleaved caspase-3、HRP標(biāo)記的IgG，洗膜、顯色、曝光。用BandScan 4.3軟件對條帶進行灰度掃描，以目的蛋白與GAPDH的灰度比值代表目的蛋白水平。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測 分組及細(xì)胞處理同前，按實驗分組更換目的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞并用PBS洗滌，行Annexin V-FITC聯(lián)合PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料均進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)的比較采用非配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義時采用LSD法進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 糖尿病組和非糖尿病組患者臨床和生化數(shù)據(jù)比較

糖尿病組患者空腹血糖、餐后2 h血糖和HbA1c明顯高于非糖尿病組患者(P<0.05)；糖尿病組傷口持續(xù)時間長于非糖尿病組(P<0.05)；年齡、性別、BMI、血壓、血脂和肝腎功能在2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、2。

表1 糖尿病組和非糖尿病組臨床資料比較

表2 糖尿病組和非糖尿病組生化資料比較

2 糖尿病組和非糖尿病組患者足部傷口皮膚細(xì)胞凋亡情況

結(jié)果表明，糖尿病患者足部傷口皮膚細(xì)胞凋亡明顯增加，發(fā)生凋亡的細(xì)胞以真皮層中的成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞為主，有少量角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生凋亡，見圖1、2。Cleaved caspase-3在非糖尿病組和糖尿病組的表達(IRS)分別為1.04±0.23和3.04±0.31，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。非糖尿病組和糖尿病組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(3.8±0.8)%和(8.4±1.5)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 AGEs對人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響

人原代皮膚成纖維細(xì)胞在正常濃度糖、持續(xù)高糖、高糖波動、AGEs中培養(yǎng)72 h后， cleaved caspase-3蛋白表達水平(目的蛋白與GAPDH的比值)分別為0.80±0.13、1.22±0.18、1.46±0.32和1.83±0.25，見圖3，細(xì)胞凋亡率分別為(2.43±0.19)%、(2.89±0.51)%、(3.99±0.24)%和(6.83±0.36)%，見圖4。 AGEs組cleavedcaspase-3蛋白表達水平和細(xì)胞凋亡率均明顯高于正常濃度糖組和持續(xù)高糖組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；正常濃度糖組、持續(xù)高糖組和高糖波動組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗結(jié)果提示相對于持續(xù)高糖和波動高糖，AGEs促進人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的作用更強。

Figure 1. The immunohistochemical staining of cleaved caspase-3 in the foot skin(×400)．A: non-diabetic control; B: diabetic group.

討 論

糖尿病足發(fā)病率高，危害性極大，是糖尿病致殘致死的重要原因。研究糖尿病皮膚病變發(fā)病機制對于促進足潰瘍愈合、預(yù)防截肢和改善糖尿病足預(yù)后具有重要意義。

細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡，對維持組織器官的正常形態(tài)和功能起重要作用。正常的創(chuàng)面愈合過程主要包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、組織成熟和重塑3個階段。在傷口組織成熟和重塑階段，炎癥細(xì)胞的清除和傷口愈合肉芽組織轉(zhuǎn)變?yōu)轳：劢M織時大量細(xì)胞成分的減少主要是遵循細(xì)胞凋亡的途徑，表明凋亡機制在傷口愈合過程中發(fā)揮作用。傷口難愈既可能與細(xì)胞的增殖減慢有關(guān)，也可能與細(xì)胞的凋亡增加有關(guān)。早期不恰當(dāng)?shù)牡蛲鲈黾邮钩衫w維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和新生血管減少可能是糖尿病傷口延緩愈合的重要原因之一[2]。在動物模型中，Darby等[3]觀察到非肥胖型糖尿病大鼠的創(chuàng)傷愈合速度明顯慢于正常大鼠對照組，糖尿病組損傷部位的細(xì)胞增殖率明顯低于對照組，細(xì)胞凋亡明顯增加，而對照組則極少觀察到細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在2型糖尿病鼠的齒齦傷口，成纖維細(xì)胞增殖僅為正常血糖組的一半；而成纖維細(xì)胞凋亡是正常血糖組的6倍，傷口愈合延遲[4]。我們在動物實驗的基礎(chǔ)上，進一步研究了人糖尿病足傷口形成后，創(chuàng)面皮膚細(xì)胞凋亡的情況。通過TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)糖尿病傷口皮膚細(xì)胞凋亡指數(shù)為(8.4±1.5)%，比非糖尿病傷口組(3.8±0.8)% 顯著增高，同時發(fā)現(xiàn)凋亡關(guān)鍵分子活化caspase-3在糖尿病足慢性傷口皮膚中的表達(IRS)是非糖尿病足患者的3倍。Caspase家族是細(xì)胞凋亡的介導(dǎo)者和執(zhí)行者，在引起凋亡中起關(guān)鍵作用。Cleaved caspase-3表達增高時提示依賴caspase途徑的細(xì)胞凋亡增加。研究結(jié)果進一步表明細(xì)胞凋亡增加是糖尿病足皮膚潰瘍遷延不愈的重要原因之一。

Figure 3. The results of cleaved caspase-3 analyzed by Western blotting in human fibroblasts treated with normal glucose (NG), sustained high glucose (SHG), fluctuant high glucose (FHG) or AGEs. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs NG group; #P<0.05 vs SHG group.

Figure 4. The results of apoptosis analyzed by flow cytometry in human fibroblasts treated with normal glucose(NG), sustained high glucose (SHG), fluctuant high glucose (FHG) or AGEs. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NG group;#P<0.05 vs SHG group.

我們對發(fā)生凋亡的細(xì)胞類型進行分析，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞以真皮層中的成纖維細(xì)胞為主，角質(zhì)形成細(xì)胞有少量發(fā)生。這可能與糖尿病病理狀態(tài)對不同類型細(xì)胞的影響不同有關(guān)。Xu等[5]報道，在糖尿病病理狀態(tài)下，炎癥因子和趨化因子活性增強，間質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化能力下降，內(nèi)皮祖細(xì)胞動員減少，血管再生能力降低，角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的遷移和增殖能力降低，凋亡增加。這些因素共同參與了糖尿病潰瘍的發(fā)生和發(fā)展。其中，糖尿病狀態(tài)對角質(zhì)形成細(xì)胞的影響以降低遷移和增殖能力為主，而對成纖維細(xì)胞的影響，除了降低遷移和增殖能力，還顯著地增加細(xì)胞凋亡。成纖維細(xì)胞是創(chuàng)面愈合的主要修復(fù)細(xì)胞之一，是構(gòu)成肉芽組織的主要成分之一，是合成和分泌多種細(xì)胞因子和合成膠原、纖維連接蛋白和透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞。因此，糖尿病病理狀態(tài)下，成纖維細(xì)胞的凋亡增加，必然阻礙皮膚潰瘍的愈合。

目前研究表明，糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展除了與血糖整體水平升高有關(guān)外，還與血糖的波動密切相關(guān)。在對細(xì)胞凋亡的影響研究中，目前認(rèn)為慢性持續(xù)高血糖和急性血糖波動均能導(dǎo)致氧化應(yīng)激，促進細(xì)胞凋亡。而血糖波動觸發(fā)的氧化應(yīng)激程度更高，損傷作用更為明顯[6-7]。Risso等[8]報道，間歇的高血糖比持續(xù)高血糖更能誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，凋亡相關(guān)基因Bcl-2表達下降和Bax表達上升更為顯著。金可可等[9]研究發(fā)現(xiàn)在糖化血紅蛋白水平相似的糖尿病大鼠中，血糖的波動幅度增大較持續(xù)高血糖狀態(tài)更能促進腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。在本研究中，持續(xù)高糖和高糖波動誘發(fā)人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡增加，而高糖波動組細(xì)胞凋亡率高于持續(xù)高糖組，提示持續(xù)慢性高血糖和血糖波動參與了糖尿病皮膚病變的發(fā)生發(fā)展，其誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞凋亡增加可能是傷口難愈的因素之一；血糖波動對成纖維細(xì)胞的損傷作用甚至比持續(xù)高血糖更嚴(yán)重。

AGEs 是還原糖和游離氨基之間經(jīng)非酶促反應(yīng)生成的終產(chǎn)物。持續(xù)高血糖引起體內(nèi)多種蛋白質(zhì)非酶糖基化及由此形成的AGEs在糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)病機制中起重要作用[10]，參與了視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變及動脈粥樣硬化等病變的發(fā)生發(fā)展。近年研究還發(fā)現(xiàn)，AGEs 也參與了糖尿病動物創(chuàng)面難愈：在糖尿病動物模型的飲食中增加AGEs攝入，發(fā)現(xiàn)可延遲糖尿病小鼠傷口的愈合[11]；另外，采用晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for AGE，RAGE)的內(nèi)源性拮抗劑sRAGE，能夠促進糖尿病小鼠的傷口愈合[12]。以上研究提示AGEs與創(chuàng)面難愈密切相關(guān)，但是AGEs影響創(chuàng)面愈合的機制未完全闡明。我們課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)AGEs通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶 9/金屬蛋白酶組織抑制劑 1、α2β1整合素和磷酸化黏著斑激酶的表達，抑制表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和增殖能力，阻礙傷口愈合[13]。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，AGEs除了抑制細(xì)胞增殖外，還顯著誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果提示糖尿病狀態(tài)下，長期高血糖促使皮膚局部組織非酶糖基化增加，皮膚AGEs堆積，引起組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常，促進細(xì)胞凋亡，是創(chuàng)面難以愈合的重要機制之一。我們的研究表明，在對人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響中，不同因素影響程度不一樣。相對于持續(xù)高血糖和血糖波動，AGEs水平升高促進凋亡的作用更強。我們在糖尿病創(chuàng)面的治療策略中，除了要平穩(wěn)地控制高血糖外，還應(yīng)重視阻斷AGEs的作用，積極尋找減少或清除AGEs的方法。探討糖尿病病理狀態(tài)下成纖維細(xì)胞的促凋亡和抗凋亡因素有助于進一步揭示糖尿病傷口難愈的機理，為臨床糖尿病難愈創(chuàng)面的治療提供新思路。

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