方 玲，代 娜，劉欣宇，李愛主

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

經(jīng)前方為臨床上治療原發(fā)性痛經(jīng)的經(jīng)驗(yàn)方，主要包括當(dāng)歸、川芎、小茴香、赤芍、玫瑰花等5味藥材。其中當(dāng)歸、川芎、小茴香3味藥的揮發(fā)油有效藥效成分均對治療痛經(jīng)起著不同程度的作用。當(dāng)歸能活血止痛，其揮發(fā)油中的藁本內(nèi)酯是血管平滑肌解痙作用的主要活性成分[1-2]。川芎主要的功能為活血止痛，常用于治療月經(jīng)不調(diào)，其揮發(fā)油同樣具有鎮(zhèn)痛、解痙的生物活性[3]。小茴香的揮發(fā)油成分反式茴香腦具有抗?jié)?、?zhèn)痛、抗癌的藥理作用[4-5]。超臨界CO2萃取技術(shù)是一種新興的提取分離技術(shù),其與水蒸氣蒸餾提取法比較提取率高、生產(chǎn)周期短、不易造成污染[6]。關(guān)于單味藥材中揮發(fā)油提取的方法有很多報(bào)道，但對于各組方配伍后的揮發(fā)油成分提取確未曾報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)針對組方中當(dāng)歸、川芎、小茴香3味藥配伍后的揮發(fā)油成分進(jìn)行提取，采用氣質(zhì)聯(lián)用的分析方法對組方中揮發(fā)性成分進(jìn)行初步分析。并且采用縮宮素所導(dǎo)致的小鼠痛經(jīng)扭體實(shí)驗(yàn)和鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)來對揮發(fā)油的藥效學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行進(jìn)一步研究。進(jìn)一步闡明化學(xué)有效成分和臨床應(yīng)用間的關(guān)系，為此組方的后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

中藥經(jīng)前方組方：當(dāng)歸、川芎、小茴香(藥材均購于天津醫(yī)藥集團(tuán)敬一堂)；無水硫酸鈉、乙酸乙酯、阿司匹林腸溶片、縮宮素注射液、苯甲酸雌二醇注射液、前列腺素、吐溫-80均來自天津伯尼爾有限公司。HA220-50-06超臨界萃取裝置；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-Q2010SE(日本島津)；高速萬能粉碎機(jī)；TG328B型電子分析天平；離心機(jī)；移液槍，電熱套，燒瓶，揮發(fā)油提取器，容量瓶，量筒等儀器均取自天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。小鼠(昆明種)共計(jì)88只，約重為20 g;SD大鼠10只，每只約重200 g，購買于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 經(jīng)前方中揮發(fā)油的超臨界CO2法提取 取當(dāng)歸、川芎、小茴香按比例混合，粉碎(40目)，取適量加入提取釜中，提取條件：萃取壓力為20 MPa，萃取溫度為40 ℃，分離Ⅰ室的溫度為45 ℃，分離Ⅱ室為室溫，2個分離室之間的壓力差為0，物料重量為2 kg。

2.2 經(jīng)前方揮發(fā)油提取物GC-MS分析 GC-MC檢測條件:毛細(xì)管柱規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm；程序升溫法，設(shè)置初溫60 ℃,保留3 min后，以5 ℃/min由初始溫度升至110 ℃，保留2 min后,以10 ℃/min的速率再次升溫至280 ℃，并且保留3 min。進(jìn)樣口溫度:60 ℃；檢測器的溫度：280 ℃；載氣∶氮?dú)?；分流?∶30；離子源溫度：200 ℃；掃描范圍：45～600 AMU；進(jìn)樣量：1 μL。

圖1 超臨界CO2提取揮發(fā)油氣相色譜圖

根據(jù)以上條件分析經(jīng)前方揮發(fā)油,得總離子流圖(圖1)。根據(jù)面積歸一化法確定每種提取物在總提取物中所占的的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。結(jié)果我們檢測出40個色譜峰并且得到了35個化合物。見表1。

表1 超臨界提取的揮發(fā)油成分

2.3 小鼠的扭體實(shí)驗(yàn) 將小鼠隨機(jī)分配，8只1組，分為模型組、吐溫組、揮發(fā)油的高劑量組、揮發(fā)油的中劑量組和揮發(fā)油的低劑量組、阿司匹林組。應(yīng)用苯甲酸雌二醇注射液提高小鼠子宮的敏感度來進(jìn)行造模，每天給予0.1 mL。造模的同時給予揮發(fā)油。在第4天給小鼠灌胃揮發(fā)油后40 min，每只小鼠腹腔注射縮宮素IU。隨后觀察每只小鼠在30 min內(nèi)的扭體次數(shù)，并且進(jìn)行了如下的記錄。見表2。

表2 對痛經(jīng)模型小鼠扭體次數(shù)的影響

注：與吐溫組比較，##P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01,△P<0.05。

經(jīng)過觀察，吐溫作為揮發(fā)油的助溶劑，在正常組給予生理鹽水的同時按照比例加入了吐溫，并沒有對小鼠扭體產(chǎn)生影響。由于在比較吐溫組與模型組時存在明顯的差異(P<0.01),即造模成功。并且揮發(fā)油的模型組與揮發(fā)油的高劑量組、揮發(fā)油的中劑量組和揮發(fā)油的低劑量組3個組之間存在顯著性的差異(P<0.01)，從小鼠的扭體平均數(shù)來看，揮發(fā)油高劑量組對于由縮宮素所導(dǎo)致的小鼠扭體有較好的抑制效果。

2.4 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)備40只雌性小鼠，隨機(jī)分成吐溫組、揮發(fā)油低劑量組、揮發(fā)油高劑量組、揮發(fā)油中劑量組和阿司匹林組，造模與給藥方法同2.3，在第4天最后1次給藥后30、60、120 min用智能熱板儀來測定小鼠的痛閾值數(shù)據(jù)，并記錄。見表3。

表3 對熱刺激小鼠疼痛的影響

注：與吐溫對照組比較,##P<0.01,#P<0.05。

與吐溫對照組比較，揮發(fā)油高劑量組能顯著提高小鼠在給藥30～120 min的痛閾值，揮發(fā)油中劑量組能提高小鼠在30～60 min內(nèi)的痛閾值(P<0.01;P<0.05)，在120 min時并沒有較好的療效。揮發(fā)油低劑量在短時間內(nèi)療效較好，而在60、120 min內(nèi)均無較好的療效。

3 結(jié)論

從表中結(jié)果看出，經(jīng)前方揮發(fā)油中，相對含量較高的為藁本內(nèi)酯和反式茴香腦，除此之外α-蒎烯、β-蒎烯、L-葑酮、L-檸檬烯等含量較多的成分均來自當(dāng)歸、川芎和小茴香,這與文獻(xiàn)報(bào)道相近[7-10]。由此可見，用超臨界萃取技術(shù)在密閉體系和較低溫度下對藥物有效成分進(jìn)行提取，對產(chǎn)品的損失率較低，有效成分不易流失。因此在后續(xù)研究中，我們可以采用合并提取的方法，這樣比單味藥單獨(dú)提取揮發(fā)油要減少資源浪費(fèi)，并且省時，更容易操作。

經(jīng)過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了當(dāng)歸的主要揮發(fā)油成分對子宮平滑肌具有抑制作用，當(dāng)子宮內(nèi)加壓時，能使子宮收縮由無節(jié)律變?yōu)橛泄?jié)律的收縮。同時放慢子宮平滑肌的收縮頻率。川芎中的揮發(fā)油同時可緩解子宮平滑肌痙攣并且起到抗炎療效[11]。

[1]孫旭美,范同梅,姜國云,等.當(dāng)歸-川芎不同配比的中醫(yī)應(yīng)用及其抗子宮痙攣的活性分析[J].吉林中醫(yī)藥,2011,31(19):906-908.

[2]康一.中藥當(dāng)歸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究[D].天津:天津大學(xué),2009.

[3]謝秀瓊,詹珂,尹蓉莉,等.川芎揮發(fā)油的研究進(jìn)展[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,18(6):581.

[4]鐘瑞敏,肖仔君,張振明,等.小茴香籽精油成分及其抗菌活性研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2007,27(6):36-40.

[5]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].2版.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2006:347-349.

[6]劉鳳臣,蔡廣知,楊建龍,等.川芎、當(dāng)歸炮制前后揮發(fā)性成分分析[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,28(1):164-166.

[7]陳楠.超臨界萃取岷縣當(dāng)歸揮發(fā)油的成分研究[J].甘肅教育學(xué)院學(xué)報(bào),2003,17(4):30-33.

[8]丁明玉,馬帥武,劉德麟.川芎和當(dāng)歸揮發(fā)油成分的比較研究[J].生命科學(xué)儀器,2005,3(3):38-41.

[9]劉洪玲,董巖.小茴香揮發(fā)油化學(xué)成分的GC/MS研究[J].齊魯藥事,2005,24(3):169.

[10]馮敬賽,楊義芳.當(dāng)歸、川芎及其藥對的超臨界提取物的GC-MS成分分析[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2009,40(10):754-757.

[11]李曉寧,安靜,庚迪,等.當(dāng)歸超臨界提取物及其不同餾分抗炎作用比較[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(9):2736-2739.