袁曉霞,宋 琳,吳 頌,關(guān)慧波

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊 830011；2.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；4.秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院,河北 秦皇島 066000)

老年性癡呆，即阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)，屬進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，涉及記憶力、理解力、判斷力、方向感等方面,以Aβ沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失為主要病理特征[1-2]。地黃飲子是防治老年性癡呆的有效常用方劑。本課題選用與人衰老和癡呆均比較接近的快速老化小鼠P8(Senescence accelerated mouse prone 8,SAMP8)作為老年性癡呆模型，試從行為學(xué)及形態(tài)學(xué)方面研究地黃飲子水丸抗老年性癡呆的作用機(jī)制。

1 材料與儀器

7月齡SAMP8小鼠24只，同源同月齡的SAMR1小鼠8只，均為雄性,體質(zhì)量(25±5) g，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年腦病研究室動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：W-J津?qū)崉?dòng)質(zhì)M準(zhǔn)字第006號(hào))。在正式實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，室溫22～26 ℃，濕度55%左右，日常光照，飲水及飼料均經(jīng)高溫蒸汽滅菌。地黃飲子水丸：熟地黃、巴戟天、山茱萸、石斛、肉蓯蓉、附子、五味子、肉桂、茯苓、麥冬、石菖蒲、遠(yuǎn)志、薄荷各15 g，生姜10 g，大棗5 g(所有藥物購(gòu)自哈爾濱松茂藥材站)，按處方比例制丸；鹽酸多奈哌齊片(安理申):10 mg/片，生產(chǎn)企業(yè)：法國(guó)PFIZER PGM公司，分包裝批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20040020。ZIL-2小鼠跳臺(tái)儀:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；JEM-1220型透射電鏡：日本電子公司；BX60光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS日本產(chǎn)；病理圖像分析系統(tǒng)：cimas Med6.0，麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司。

2 方法

3 結(jié)果

3.1 地黃飲子對(duì)SAMP8小鼠跳臺(tái)行為學(xué)的影響 見(jiàn)表1。

表1 地黃飲子對(duì)SAMP8小鼠跳臺(tái)行為學(xué)的影響

注：與模型組比較,#P<0.05，##P<0.01;與第1天比較,△P<0.05，△△P<0.01。

第1、2天各組的潛伏期數(shù)據(jù)經(jīng)Levene’s方差齊性檢驗(yàn)，P≤0.10，該數(shù)據(jù)為方差不齊。首先以多個(gè)獨(dú)立樣本比較的Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn),P<0.05，認(rèn)為各組有差異。進(jìn)一步采用LSD法做多重比較。結(jié)果表明空白組的潛伏期與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。給藥后，地黃飲子組和安理申組潛伏期與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 相同組的第2天潛伏期與第1天比較采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，結(jié)果表明第2天潛伏期與第1天比較除模型組以外，各組均非常顯著延長(zhǎng)(P<0.01)。

3.2 地黃飲子對(duì)SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 HE染色光鏡下可見(jiàn)：空白組SAMR1小鼠海馬CA1及CA3區(qū)結(jié)構(gòu)完整正常，神經(jīng)元排列整齊致密，層次清楚，細(xì)胞核多呈圓形，大且規(guī)則，核仁清晰。模型組海馬CA1及CA3區(qū)細(xì)胞排列紊亂、疏松，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，層次性較差，且細(xì)胞腫脹，多見(jiàn)核深染、固縮現(xiàn)象，神經(jīng)元呈彌漫性顆?？张葑冃?。地黃飲子組與安理申組海馬CA1及CA3區(qū)的神經(jīng)元病理表現(xiàn)較模型組有明顯改善，神經(jīng)元排列較疏松紊亂，細(xì)胞層數(shù)較空白組相對(duì)減少，細(xì)胞腫脹，核深染、固縮現(xiàn)象及神經(jīng)元顆?？张葑冃缘惹闆r較模型組明顯減少。安理申組與地黃飲子組比較，其CA3區(qū)神經(jīng)元病理改善程度更明顯，2組CA1區(qū)情況基本一致。

3.3 地黃飲子對(duì)SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響 電子顯微鏡下觀察各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)：空白組海馬區(qū)神經(jīng)元胞體密集排列，細(xì)胞核以常染色質(zhì)為主，核仁明顯，神經(jīng)氈區(qū)未見(jiàn)纖維的纏繞。神經(jīng)元細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核膜圓滑，核仁清晰。核膜雙層結(jié)構(gòu)清晰，胞漿內(nèi)可見(jiàn)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)游離核糖體、少量的溶酶體及神經(jīng)微絲。高倍鏡下可見(jiàn)神經(jīng)元胞體內(nèi)含有豐富的游離核蛋白體和尼氏小體。模型組海馬神經(jīng)元排列非常紊亂，而且神經(jīng)元胞體固縮，核膜下可見(jiàn)高密度染色質(zhì)邊集，或塊狀散布核內(nèi)，核膜模糊，出現(xiàn)神經(jīng)元早期凋亡的變化，神經(jīng)元胞體內(nèi)尼氏體擴(kuò)張、脫顆粒，線粒體空泡變性，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量脂褐素。神經(jīng)氈區(qū)神經(jīng)纖維纏繞，紊亂排列，神經(jīng)纖維內(nèi)線粒體嵴性腫脹。膠質(zhì)細(xì)胞核固縮，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多。安理申組神經(jīng)元形態(tài)基本正常，核膜圓滑，核仁清晰。核膜雙層結(jié)構(gòu)清晰。個(gè)別神經(jīng)元線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略有減少，溶酶體稍增多，脂褐素略有增多，核膜下有極輕微的染色質(zhì)邊集，核膜、核周隙間斷性增寬，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒。部分神經(jīng)纖維有腫脹，髓鞘輕度崩解。地黃飲子組神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，核膜圓滑，核仁清晰。核膜雙層結(jié)構(gòu)清晰，線粒體形態(tài)正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略有減少，溶酶體稍增多，脂褐素消失，核內(nèi)有異染色質(zhì)的塊狀散布。神經(jīng)纖維紊亂纏繞。

4 討論

老年性癡呆與中醫(yī)“癡呆”“呆病”“健忘”“癲病”“郁證”等相類(lèi)似[4]。腦性清靈，腦清則神明，主持有度，靈動(dòng)機(jī)敏，思維敏捷，反應(yīng)靈敏[5]。腦失清靈而發(fā)的老年性癡呆，以本虛標(biāo)實(shí)為基本病機(jī)。本虛主要在于腎精不足，髓海虧虛，清陽(yáng)不升，腦髓失養(yǎng)；標(biāo)實(shí)在于痰濁、瘀血或痰濁瘀血互結(jié)蒙蔽清竅，閉阻腦絡(luò)。本虛與標(biāo)實(shí)兩者之間又互為因果，腎虛可以導(dǎo)致痰濁、瘀血，痰濁、瘀血又可反過(guò)來(lái)加重腎虛，形成惡性循環(huán)，以致本病纏綿難愈。何慧等[6]對(duì)老年性癡呆的中醫(yī)治則治法規(guī)律進(jìn)行研究，也驗(yàn)證了老年性癡呆的病機(jī)關(guān)鍵在于腎；治療以補(bǔ)腎為主，兼以活血化瘀，化痰開(kāi)竅。中藥治療老年性癡呆備受關(guān)注[7]。中藥方劑具有多靶點(diǎn)效應(yīng)，作為一個(gè)整體進(jìn)入人體，通過(guò)多成分、多途徑、多層次的綜合協(xié)調(diào)作用，可以調(diào)動(dòng)機(jī)體的自穩(wěn)態(tài)及自我修復(fù)能力，從而達(dá)到治療作用[8]。

SAMP8小鼠主要的特點(diǎn)就是在渡過(guò)生長(zhǎng)期(4～6月)后，伴快速老化自然發(fā)生的認(rèn)知障礙，這與臨床癡呆的漸進(jìn)性發(fā)生是極為相似的。與其同源對(duì)照組R1相比，其行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、神經(jīng)生化、多種酶類(lèi)以及蛋白質(zhì)和基因表達(dá)等均出現(xiàn)異常[9]。因此有學(xué)者認(rèn)為，SAMP8小鼠是目前較理想的老年性癡呆替代模型[10]。

小鼠跳臺(tái)行為實(shí)驗(yàn)顯示，第1、2天的模型組潛伏期與空白組比較縮短，提示SAMP8小鼠被動(dòng)回避反應(yīng)能力下降，學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低。給藥后地黃飲子組和西藥對(duì)照組均可使各組小鼠潛伏期延長(zhǎng)，表明被動(dòng)反應(yīng)能力均有所提高，與模型組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明地黃飲子有類(lèi)似安理申提高SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用，且2組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第2天潛伏期與第1天比較，除模型組以外，其他各組均非常顯著延長(zhǎng)，提示空白組和安理申組、地黃飲子組記憶能力增強(qiáng)。 經(jīng)地黃飲子治療的SAMP8小鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元排列較疏松紊亂,細(xì)胞層數(shù)減少，細(xì)胞腫脹、核深染、固縮現(xiàn)象及神經(jīng)元顆?？张葑冃暂^模型組明顯減少。SAMP8小鼠經(jīng)地黃飲子治療能減輕海馬神經(jīng)元的損傷,提高其學(xué)習(xí)記憶能力。

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