萬 軍 車 云 康寧寧

信號通路蛋白Akt1、ERK1/2與HIF-1α在肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

萬 軍 車 云 康寧寧

目的 探討信號通路蛋白Akt1、ERK1/2與HIF-1α在肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 采用免疫組化方法(Envision二步法)，檢測100例肺癌Akt1、ERK1/2和HIF-1α蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 Akt1、ERK1/2及HIF-1α蛋白在肺癌組織中均呈不同程度表達(dá)，其陽性表達(dá)率分別為63.00%、68.00%和52.00%；Akt1與HIF-1α表達(dá)具有明顯相關(guān)性(γ=0.673，P=0.000)，ERK1/2與HIF-1α表達(dá)亦具有明顯相關(guān)性(γ=0.568，P=0.000)；Akt1、ERK1/2和HIF-1α表達(dá)均與肺癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P<0.01)。結(jié)論 Akt1、ERK1/2和HIF-1α在肺癌中均呈高水平表達(dá)，Akt1、ERK1/2與HIF-1α表達(dá)具有明顯相關(guān)性，三者均與肺癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，三者聯(lián)合檢測對肺癌診斷、治療及預(yù)后具有重要意義。

Akt1；ERK1/2；HIF-1α；肺癌

(ThePracticalJournalofCancer，2014，29：1515～1517)

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，最新研究報道肺癌的死亡率仍居各種腫瘤的首位[1]。隨著我國疾病譜的改變，肺癌已成為我國城鄉(xiāng)惡性腫瘤死亡首要原因，占全部惡性腫瘤死亡的22.7%[2]。近年來，肺癌的發(fā)病率逐年遞增，引起廣泛的關(guān)注[3]。肺癌晚期常是難治愈的，化療是晚期肺癌的主要治療手段之一，此時的治療目標(biāo)是減輕癥狀、提高生活質(zhì)量、延長壽命。對于患者來說，提高其生活質(zhì)量更有切身的好處。缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)蛋白在大多數(shù)腫瘤組織及其轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白水平的調(diào)控除了受到環(huán)境氧濃度影響外還存在其他調(diào)控機制[4]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinase，ERK)與蛋白激酶B(protein kinase，PKB，Akt)均在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的調(diào)控作用，本文對我院收治的肺癌患者進行肺癌組織中HIF-1α與Akt1、ERK1/2表達(dá)的水平，探討HIF-1α與Akt1，HIF-1α與ERK1/2表達(dá)水平的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2012年6月-2014年6月我院收治的肺癌患者100例，其中男性55例，女性45例；年齡56～85歲，平均(65.9±13.8)歲。所有病例均參照世界衛(wèi)生組織2007年公布的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中鱗癌26例(高中分化15，低分化11例)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例；TNMⅠ～Ⅱ期20例，Ⅲ期6例)，腺癌61例(高中分化33，低分化28例)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例；TNMⅠ～Ⅱ期40例，Ⅲ期21例)，小細(xì)胞肺癌13例(高中分化5，低分化8例；均發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；TNMⅠ～Ⅱ期7例，Ⅲ期6例)。

1.2 試劑

Akt1兔抗人單克隆抗體，HIF-1α鼠抗人單克隆抗體，ERK1/2鼠抗人單克隆抗體為Epigentek公司生產(chǎn)。氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒及Envision二步法免疫組化試劑盒均為中杉金橋生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本取材 經(jīng)我院倫理委員會論證批準(zhǔn)，收集患者術(shù)中切除肺癌組織，于術(shù)后2 h內(nèi)完成標(biāo)本取材，標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，梯度酒精脫水、石蠟包埋，備用。

1.3.2 病理組織學(xué)檢查 將患兒標(biāo)本4 μm連續(xù)切片6～7張，行常規(guī)病理檢查(HE，MASSON，PAS，PASM+MASSON)，采用高清晰度圖文分析系統(tǒng)進行分析。

1.3.3 Akt1、ERK1/2及HIF-1α表達(dá)檢測 采用Envision二步法進行Akt1、ERK1/2及HIF-1α表達(dá)定位及半定量分析。嚴(yán)格按試劑盒說明書進行操作。標(biāo)本經(jīng)4 μm連續(xù)切片，置60℃烤箱60 min烤干。經(jīng)二甲苯脫蠟，酒精梯度水化至蒸餾水。3%過氧化氫室溫處理15 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗滌2 min，微波修復(fù)抗原10 min，滴加一抗：ERK1/2鼠抗人單克隆抗體，Akt1兔抗人單克隆抗體，HIF-1α鼠抗人單克隆抗體用PBS按1∶100稀釋，每張切片滴加稀釋的一抗50 μl，4 ℃孵育過夜。次日PBS沖洗切片3次，每次3～5 min。每張切片滴加二抗生物素化羊抗兔IgG 50 μl，在37 ℃恒溫箱孵育30 min。PBS沖洗切片3次，每次3～5 min。每張切片滴加DAB 50 μl顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，中性樹脂封片。陰性對照以PBS緩沖液代替一抗。每張切片隨機抽取5個高倍鏡下視野，計算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.3.4 結(jié)果判定 應(yīng)用彩色病理圖像分析系統(tǒng)在高倍鏡下測定免疫組化結(jié)果。肺癌切片中出現(xiàn)棕黃或棕黑色物為Akt1、ERK1/2及HIF-1α陽性染色，不著色為陰性。分級標(biāo)準(zhǔn)：Photoshop軟件圖像分析測量陽性染色區(qū)域占總面積的百分比。所有區(qū)域陽性染色面積<10%為(-)，11%～50%定為(+)，51%～80%定為(++)，>81%定為(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行分析處理，Kruskal-Walls檢驗用于多個獨立樣本差異比較，相關(guān)性分析采用Spearman等級。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Akt1、ERK1/2及HIF-1α表達(dá)形態(tài)特征

免疫組化結(jié)果顯示，Akt1、ERK1/2及HIF-1α蛋白在肺癌組織中均呈不同程度表達(dá)，分別有63例、68例和52例檢出，其陽性率分別為63.00%、68.00%和52.00%。Akt1、ERK1/2及HIF-1α蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜呈粗細(xì)不等的棕黃色顆粒，陰性細(xì)胞胞質(zhì)胞膜均不著色，胞核呈紫藍(lán)色。

2.2 Akt1、ERK1/2與HIF-1α表達(dá)相關(guān)性

Akt1、ERK1/2與HIF-1α表達(dá)相關(guān)性Spearman分析結(jié)果分別見表1和表2。結(jié)果顯示，Akt1與HIF-1α表達(dá)具有明顯相關(guān)性(γ=0.673，P=0.000)，ERK1/2與HIF-1α表達(dá)亦具有明顯相關(guān)性(γ=0.568，P=0.000)。

表1 Akt1與HIF-1α表達(dá)相關(guān)性

表2 ERK1/2與HIF-1α表達(dá)相關(guān)性

2.3 Akt1、ERK1/2和HIF-1α表達(dá)與肺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

Akt1、ERK1/2和HIF-1α表達(dá)均與肺癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P<0.01)，分化程度高，淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移和TNM分期高的患者Akt1、ERK1/2和HIF-1α陽性表達(dá)率也高，見表3。

表3 Akt1、ERK1/2和HIF-1α與肺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

3 討論

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinase，ERK)是多種生長因子、細(xì)胞因子調(diào)控細(xì)胞增殖的重要途徑，具有調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、分化、周期循環(huán)等功能，在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用[5]。蛋白激酶B(protein kinase，PKB，Akt)是PI3K /Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，的關(guān)鍵分子，其活化受控于嚴(yán)密精確的分子機制，多種疾病如癌癥和糖尿病常伴隨Akt調(diào)控的紊亂[6-7]。李龍等報道證實，ERK1/2在肺癌及外周組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中其重要的作用，且與表皮生長因子受體表達(dá)明顯相關(guān)[8]。然而有關(guān)Akt1、ERK1/2與HIF-1α在肺癌組織中的相關(guān)性分析未見報道。

本文同時檢測了不同分期及病變肺癌組織中Akt1、ERK1/2和HIF-1α的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Akt1、ERK1/2及HIF-1α蛋白在肺癌中均有不同程度的表達(dá)，分別有63例、68例和52例檢出，其陽性率分別為63.00%、68.00%和52.00%，表明Akt1、ERK1/2和HIF-1α在肺癌中均呈高表達(dá)的水平。谷艷嬌等[9]同樣報道ERK1/2在肺癌組織中的高表達(dá)態(tài)勢。

缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)哺乳動物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧狀態(tài)下由血管生成，可影響其他細(xì)胞因子的表達(dá)[10]。本文中分別對Akt1、ERK1/2與HIF-1α的表達(dá)相關(guān)性分析顯示，Akt1與HIF-1α表達(dá)具有明顯的相關(guān)性(γ=0.673，P=0.000)，ERK1/2與HIF-1α表達(dá)亦具有明顯的相關(guān)性(γ=0.568，P=0.000)。PKB/Akt在多種癌癥中具有重要作用，在乳腺和前列腺癌細(xì)胞中PKB/Akt激活后，通過調(diào)節(jié)HIF-α調(diào)節(jié)表皮生長因子受體的表達(dá)，而表皮生長因子受體是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要因素[11]。因此，本文認(rèn)為，Akt1與HIF-1α的表達(dá)相關(guān)性證明在肺癌細(xì)胞中PKB/Akt通路通過調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)水平參與到肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中。有關(guān)ERK1/2與HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性報道較少。ERK是MAPK家族成員之一，屬于絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶，活化后進入細(xì)胞核作用于多種轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶等，而HIF-1α主要位于細(xì)胞核，因此本文推斷HIF-1α可能為ERK1/2的主要下游調(diào)節(jié)成員之一。HIF-1主要由α和β兩個亞基以異源二聚體的形式存在，前者是其氧調(diào)節(jié)單位，正常生理條件下微環(huán)境的氧濃度通過調(diào)控HIF-1α的降解速度來控制HIF-1對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)Akt1、ERK1/2和HIF-1α均與肺癌分化程度、淋巴是否轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P<0.01)，分化程度高，淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分期高的患者Akt1、ERK1/2和HIF-1α陽性表達(dá)率高。提示Akt1、ERK1/2和HIF-1α可作為肺癌早期診斷的標(biāo)志物之一，具有成為肺癌新藥研發(fā)的靶點之一的潛質(zhì)，參與到了肺癌發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的各個環(huán)節(jié)。

綜上所述，Akt1、ERK1/2和HIF-1α在肺癌中均呈高表達(dá)的水平，Akt1、ERK1/2與HIF-1α表達(dá)具有明顯的相關(guān)性，三者均與肺癌分化程度、淋巴是否轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，聯(lián)合檢測三者對肺癌診斷、治療及預(yù)后具有重要意義。

[1] 張立國，劉廣杰，趙俊敏，等.肺癌早期診斷進展〔J〕.河北醫(yī)藥，2014，36(14)：2179-2182.

[2] 陳涵一，楊 琛，閆 蓓，等.浦東新區(qū)不同組織學(xué)類型肺癌發(fā)病及生存情況〔J〕.中國肺癌雜志，2014，17(3)：203-208.

[3] Yatabe Y.Recent changes in the therapeutic strategy for - NSCLC in association with new anti-cancer agents〔J〕.Rinsho Byori，2013，61(4)：328-333.

[4] 朱 宏.食管癌細(xì)胞PI3K/AKT-HIF-lα通路對糖酵解的影響〔D〕.南京：南京醫(yī)科大學(xué)，2013.

[5] 梁 佳，包翠芬，魏 嘉，等.P38和ERK1/2在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義〔J〕.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2009，18(2)：202-205.

[6] 李 圍，楊曉明.Akt1與凋亡誘導(dǎo)因子AIF相互作用的研究〔J〕.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2008，5(4)：283-286，327.

[7] Hanada M，F(xiàn)eng J，Hemmings BA，et al.Structure，regulation and function of PKB /AKT-α major therapeutic target 〔J〕.Biochim Biophys Acta，2004，1697(1-2)：3-16.

[8] 李 龍，張 紅，唐發(fā)兵，等.肺癌組織表皮生長因子受體與RAS/MARK信號通路活化蛋白ERK1/2表達(dá)的相關(guān)性及臨床分析〔J〕.東南大學(xué)學(xué)報，2013，32(2)：218-221.

[9] 谷艷嬌，包翠芬，魏 嘉，等.ERK1/2和p-ERK 1/2在肺癌組織中的表達(dá)及意義〔J〕.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2009，18(3)：328-331.

[10] 王愛萍，杜玉曉，王 軍，等.磷酸化蛋白激酶B和缺氧誘導(dǎo)因子1α在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.中國臨床研究，2010，23(1)：8-10.

[11] Dimmeler S，Zeiher AM.Akt takes center stage in angiogenesis signaling〔J〕.Cire Res，2000，86(1)：4-5.

(編輯：吳小紅)

Correlation of Signal Pathway Protein Akt1、ERK1/2 and HIF-1α Expression in Lung Cancer Tissues and Their Clinical Significance

WANJun，CHEYun，KANGNingning.

TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Hefei，230022

Objective To investigate the expression of signal pathway protein Akt1、ERK1/2 and HIF-1α in lung cancer tissues and their clinical significance.Methods Expression of Akt1、ERK1/2 and HIF-1α in 100 cases of lung cancer were detected by Envision two-step immunohistochemical method.Results Akt1、ERK1/2 and HIF-1α were all found expressed in lung cancer tissues and the positive expression rates were 63.00%，68.00% and 52.00%，respectively；There was significant correlation between expression of Akt1 and HIF-1α (γ=0.673，P=0.000)，and there was significant correlation between expression of ERK1/2 and HIF-1α (γ=0.568，P=0.000)；The expression of Akt1、ERK1/2 and HIF-1α were correlated with differentiation degree，lymphatic metastasis and TNM staging (P<0.01).Conclusion High expression of Akt1、ERK1/2 and HIF-1α in lung cancer tissue is observed.Akt1、ERK1/2 and HIF-1α are closely correlated，and they are all correlated with differentiation degree，lymphatic metastasis and TNM staging.Combined detection of Akt1、ERK1/2 and HIF-1α is of vital significance for diagnosis，treatment and prognosis of lung cancer.

Akt1；ERK1/2；HIF-1α；Lung cancer

國家自然科學(xué)基金(編號：81302028)；安徽省自然科學(xué)基金(編號：1208085QH159)

230022 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普胸外科

10.3969/j.issn.1001-5930.2014.12.002

R734.2

A

1001-5930(2014)12-1515-03

2014-10-08

2014-10-20)