馬翊竑，張海東，齊軍，李峰

論著·基礎(chǔ)

芍藥苷對血管性癡呆模型大鼠乙酰膽堿酯酶及超氧化物歧化酶的影響

馬翊竑，張海東，齊軍，李峰

目的觀察芍藥苷(PF)對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及乙酰膽堿酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)水平的影響。方法50只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、給藥組(芍藥苷低劑量組12.5 mg/kg、中劑量組25 mg/kg、高劑量組50 mg/kg)，每組10只。模型組與給藥組采用反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動脈(CCA)結(jié)合腹腔注射硝普鈉法造模，假手術(shù)組不阻斷CCA及注射硝普鈉。造模后第2天給藥組予灌胃給藥，模型組與假手術(shù)組給予生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)30 d。應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、跳臺實(shí)驗(yàn)測定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并比較各組AchE、SOD活性。結(jié)果(1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：模型組和假手術(shù)組定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期均逐漸縮短，第5天明顯比第1天短(P<0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組潛伏期在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均延長，而穿過平臺的次數(shù)明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，給藥組潛伏期呈縮短趨勢，第5天比第1天短(P<0.05)；穿過平臺的次數(shù)明顯增加(P<0.05或P<0.01)。(2)跳臺實(shí)驗(yàn)：與假手術(shù)組比較，模型組錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加，而潛伏期明顯縮短(P<0.01)；與模型組比較，3個(gè)給藥組的錯(cuò)誤次數(shù)均明顯降低, 潛伏期均高于模型組(P<0.05或P<0.01)。與低、中劑量組比較，高劑量組潛伏期延長更顯著(P<0.01)。(3)腦組織勻漿中AchE、SOD活性：與假手術(shù)組比較，模型組AchE活性增高、SOD 活性降低(P均<0.01)；與模型組比較，低、中、高劑量組AchE活性明顯降低、SOD活性均升高(P<0.05或P<0.01)；與低劑量組相比，高劑量組AchE活性降低(P<0.05),SOD活性明顯升高(P<0.01)；與中劑量組相比，高劑量組SOD活性升高(P<0.05)。結(jié)論芍藥苷對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙有改善作用,其機(jī)制之一可能是基于抑制AchE活性，增加SOD的活性。

芍藥苷；血管性癡呆；乙酰膽堿；超氧化物歧化酶；大鼠

隨著我國人口老齡化的到來,腦血管病發(fā)病率也一直居高不下,雖然腦血管病的病死率有所下降,但由此造成血管性癡呆(vascular dementia,VD)的發(fā)病率卻正在逐年上升。目前對VD的病理機(jī)制尚不完全清楚，但有研究認(rèn)為，氧自由基廣泛參與VD的病理過程，氧自由基引起的組織脂質(zhì)過氧化損傷對病情進(jìn)展起著重要作用[1，2]。芍藥苷(paeoniflorln，PF)是芍藥的主要有效成分之一，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，可以改善D-半乳糖和亞硝酸鈉誘導(dǎo)的認(rèn)知功能損傷，提高清除ROS的抗氧化物活性及降低MDA水平，但是有關(guān)其對VD的保護(hù)作用及作用機(jī)制方面的研究報(bào)道較少[3]。本實(shí)驗(yàn)將通過檢測過氧化物歧化酶(SOD)活性、乙酰膽堿酯酶(AchE)活性的變化,探討芍藥苷對VD模型大鼠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 成年Wistar雄性大鼠50只，育齡8周，體質(zhì)量240～250 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20℃左右，自然光照，通風(fēng)良好，避免強(qiáng)光、噪音刺激，動物可以自由進(jìn)食和飲水。芍藥苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：110736-201337)；Morris水迷宮(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物實(shí)驗(yàn)室)，跳臺儀(JXDT-I，上海易聯(lián)科學(xué)儀器)；SOD試劑盒、AchE試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 動物分組及給藥 采用Morris水迷宮篩選空間學(xué)習(xí)記憶能力相近的Wistar大鼠，隨機(jī)分為5組，每組10只，即假手術(shù)組、模型組、芍藥苷低劑量組(12.5 mg/kg)、中劑量組(25 mg/kg)、高劑量組(50 mg/kg)，造模后第2天即灌胃給藥，每天1次，連續(xù)30 d，各組大鼠自由進(jìn)食。大鼠造模后第2天稱質(zhì)量，按體質(zhì)量劑量比例灌胃給藥。假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)灌胃30 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 VD模型建立: 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中大鼠的成活率，采用反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動脈 (CCA) 結(jié)合腹腔注射硝普鈉法造模[4]。術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，將大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，用彎剪去除頸部毛，常規(guī)消毒后，頸部正中切口，鈍性分離雙側(cè)CCA，術(shù)中要盡量避免刺激迷走神經(jīng)，模型組和給藥組在夾閉雙側(cè)CCA之前，腹腔注射硝普鈉，隨即用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)CCA，10 min后，再通10 min,再夾閉10 min，再通后縫合切口，連續(xù)3 d。假手術(shù)組除不阻斷CCA及注射硝普鈉外均與模型組相同。

1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)： Morris水迷宮由直徑120 cm、高45 cm的圓形水池，直徑13 cm、高15 cm的圓形平臺及自動錄像、記錄系統(tǒng)4部分組成。水池內(nèi)充以潔凈自來水(20±1)℃,水中加20 ml無毒碳素墨水，以遮蔽安全平臺。實(shí)驗(yàn)中水池被象征性劃分為I、II、III、IV 4個(gè)象限區(qū)域，將平臺置于第III象限正中距離池壁40 cm處，水面高于平臺頂1 cm。水池上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，同步記錄小鼠運(yùn)動軌跡。

1.3.3 跳臺實(shí)驗(yàn)： 在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)完成1周后進(jìn)行跳臺實(shí)驗(yàn)，跳臺實(shí)驗(yàn)箱為55 cm×11 cm×33 cm的塑料箱，在箱底鋪有銅柵欄作為刺激電極，箱內(nèi)后左側(cè)放置一個(gè)直徑4.5 cm、高4.5 cm的橡皮墊作為逃避電擊的安全臺。將大鼠放入箱內(nèi)先適應(yīng)5 min，然后通以36V 交流電，正常情況下，在受到電擊后動物應(yīng)該跳到安全平臺上。記錄大鼠在5 min內(nèi)受到電擊的次數(shù)即為錯(cuò)誤次數(shù)，24 h后重新測1次，將大鼠放置安全平臺上，記錄大鼠在平臺上停留的時(shí)間長短即為潛伏期。

1.3.4 腦組織勻漿制備： 完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，斷頭處死大鼠，在冰上迅速分離全腦，將取得的腦組織切成小組織塊, 用 4℃生理鹽水沖洗，在冰水溶液中用玻璃勻漿器研磨制成勻漿，于4℃、3 500 r/min離心10 min,取上清液, 即制成10%腦組織勻漿，分裝于-80℃條件下保存。

1.3.5 AchE活性檢測： 取制好的腦組織勻漿，按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明進(jìn)行。根據(jù)顏色深淺進(jìn)行比色定量，最后使用酶標(biāo)儀在420 nm處測定各管吸光度值。按照說明書上計(jì)算公式計(jì)算AchE活力(U/mg)，并記錄[5]。

1.3.6 SOD活性檢測： 取制好的腦組織勻漿，按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明進(jìn)行操作。使用酶標(biāo)儀在550 nm處測定各管吸光度值，通過公式計(jì)算可求出被測樣品中的SOD活力[6]。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期的變化： (1)假手術(shù)組、模型組及各給藥組潛伏期均逐漸縮短，第5天明顯短于第1天(P<0.05)；(2)與假手術(shù)組比較，模型組潛伏期在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均延長(P<0.01)；與模型組比較，低、中、高劑量組均縮短(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組與中劑量組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中各組逃避潛伏期的比較

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn)中空間記憶的變化： (1)與假手術(shù)組比較，模型組大鼠穿過平臺的次數(shù)明顯減少[(9.3±3.1)次 vs (3.6±1.4)次，P<0.01]，提示模型組大鼠有明顯的定位記憶障礙。(2)與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠穿過平臺的次數(shù)明顯增加[分別為(5.0±1.3)次、(5.8±1.6)次、(6.5±2.0)次，P<0.05]。提示芍藥苷可明顯提高大鼠的空間記憶。給藥組間兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示芍藥苷提高大鼠的空間記憶可能與藥物劑量相關(guān)。

2.2 跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 大鼠錯(cuò)誤次數(shù)： (1)與假手術(shù)組比較，模型組錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加(P<0.01)；(2)與模型組比較，3個(gè)給藥組的錯(cuò)誤次數(shù)均明顯降低(P<0.01)，且以中劑量組效果最為顯著；(3)低、中、高劑量組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.2.2 大鼠平臺潛伏期比較： (1)與假手術(shù)組比較，模型組潛伏期明顯縮短(P<0.01)；(2)與模型組相比較，低、中、高劑量組的潛伏期均明顯延長(P<0.05或P<0.01)；隨著藥物劑量的增加，潛伏期逐漸延長。與低劑量組比較，高劑量組延長更顯著(P<0.01)，但中劑量組與高劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01；與低劑量組比較，dP<0.01

2.3 腦組織勻漿中AchE活性 (1)與假手術(shù)組比較，模型組膽堿酯酶活性增高(P<0.01)；(2)與模型組比較，低、中、高劑量組膽堿酯酶活性明顯降低(P<0.05或P<0.01)；(3)給藥組組內(nèi)兩兩相比，僅高劑量組的膽堿酯酶活性比低劑量組降低(P<0.05)。見圖4。

2.4 腦組織勻漿中SOD活性 (1)與假手術(shù)組比較，模型組SOD 活性降低(P<0.01)；(2)與模型組比較，低、中、高劑量組SOD活性均升高(P<0.05或P<0.01)；(3)與低劑量組相比，中、高劑量組的SOD活性明顯升高(P<0.05)，與中劑量組相比，高劑量組SOD活性升高(P<0.05)。見圖5。

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01；與低劑量組比較，dP<0.05

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01；與低劑量組相比，dP<0.05；與高劑量組比較，eP<0.05

3 討 論

目前認(rèn)為, 血管性癡呆患者出現(xiàn)智能減退主要是由于大腦皮質(zhì)聯(lián)絡(luò)區(qū)、海馬及其鄰近結(jié)構(gòu)、杏仁核、丘腦和腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等區(qū)域內(nèi)大量的神經(jīng)細(xì)胞壞死，致使大腦內(nèi)Ach的含量減少[7]。本研究的定位航行實(shí)驗(yàn)中,模型組大鼠的逃避潛伏期比假手術(shù)組大鼠的潛伏期明顯延長；空間探索實(shí)驗(yàn)中,模型組大鼠跨過平臺所在位置的次數(shù)明顯減少，均說明血管性癡呆模型大鼠具有明顯的記憶、認(rèn)知障礙。而當(dāng)腦內(nèi)乙酰膽堿的含量降低時(shí),即伴發(fā)學(xué)習(xí)、記憶能力喪失，AchE作為膽堿能系統(tǒng)的關(guān)鍵酶,其活性可以直接反映膽堿能系統(tǒng)的功能狀態(tài)[8]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組AchE活性比假手術(shù)組明顯增高，說明其Ach含量是少于假手術(shù)組的，而給藥組AchE活性均比模型組低，表明芍藥苷能抑制AchE活性從而提高腦組織中Ach含量，改善癡呆癥狀。

SOD是體內(nèi)重要的自由基清除劑，可以保護(hù)細(xì)胞不受毒性氧自由基損傷。隨著人年齡的增長, 人體對自由基的清除作用也會逐漸減弱，致使體內(nèi)自由基過多聚集，導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死[9，10]。本研究中，給藥組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力與模型組相比有顯著差異，說明芍藥苷能改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，而在腦組織AchE和SOD活性的檢測中，給藥組與模型組大鼠相比較差異顯著，且與劑量相關(guān)，說明芍藥苷可能是通過抑制AchE活性提高腦組織內(nèi)Ach含量，提高腦內(nèi)SOD活性，改善癡呆癥狀的，所以對于臨床上血管性癡呆患者出現(xiàn)的學(xué)習(xí)記憶障礙，其具有一定的治療意義。

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Theeffectofpaeoniflorlnonratmodelofvasculardementiaacetylcholinesteraseandsuperoxidedismutase

MAYihong,ZHANGDonghai,QIJun,LIFeng.

DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China

LIFeng，E-mail:harbinlifeng@163.com

ObjectiveTo observe the effect of paeoniflorin (PF) on the vascular dementia rats learning and memory ability, and acetylcholinesterase (AchE), superoxide dismutase (SOD) level.MethodsFifty Wistar rats were randomly divided into sham operation group, model group, drug group (paeoniflorin low dose group with 12.5 mg/kg, middle dose group with 25 mg/kg, high dose group with 50 mg/kg), with 10 rats in each group. The model group and the treatment group by repeated clamping of bilateral common carotid artery (CCA) model combined with intraperitoneal injection of sodium nitroprusside, sham operation group did not block the CCA and injection of sodium nitroprusside. After second day of establish the mode, treatment group was given intragastric administration, the model group and the sham operation group were given normal saline, 1 times a day, continuous 30 d. Application of Morris water maze test, step-down test the learning and memory ability of rats, and comparison of AchE, SOD activity.Results(1) Morris water maze experiment: model group and sham operation group positioning navigation test in escape latency gradually shortened, fifth days shorter than first days (P<0.05); compared with the sham operation group, model group were prolonged incubation at each time point, and through the platform was significantly reduced (P<0.01); compared with the model group, drug group latency showed a trend of shortening, fifth days more shorter than first days (P<0.05); times across the platform significantly increased (P<0.05 orP<0.01). (2) In step-down test: compared with the sham operation group, model group, the number of errors increased significantly,and was significantly shortened (P<0.01); compared with the model group, the 3 groups were significantly decreased the number of errors, the latency was higher than that in the model group (P<0.05 orP<0.01). Compared with the low,middle dose group, high dose group had significantly more prolonged latency (P<0.01). (3) AchE, SOD activity of brain homogenates: compared with the sham operation group, model group, AchE decreased, SOD activity increased (P<0.01); compared with the model group, low, middle and high dose group's AchE activity decreased, SOD activity increased (P<0.05 orP<0.01); compared with the low dose group, high dose group AchE activity decreased (P<0.05), the activity of SOD increased significantly (P<0.01); compared with middle dose group, high dose group's activity of SOD increased (P<0.05).ConclusionPaeoniflorin improved vascular dementia rats learning and memory ability, one of the possible mechanisms is on the basis of inhibition of AchE activity to increase the activity of SOD.

Paeoniflorin; Vascular dementia; Acetylcholine esterase;Superoxide dismutase;Rats

150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

李峰，E-mail:harbinlifeng@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.07.021

2014-03-28)