王振常，楊刪，黃晶晶，呂健林

論著·基礎(chǔ)

柔肝化纖顆粒對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟 MMP-2、TIMP-2的影響

王振常，楊刪，黃晶晶，呂健林

柔肝化纖顆粒；肝纖維化；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-2抑制劑；大鼠

細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matrix,ECM)降解減少、沉積過(guò)多是肝纖維化重要的形成機(jī)制之一，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)具有可降解大部分ECM成分的作用，MMP與其抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP)的表達(dá)在調(diào)控ECM的合成與降解中起著關(guān)鍵作用，MMP與TIMP失衡會(huì)引起ECM在肝內(nèi)的代謝異常而導(dǎo)致肝纖維化形成[1]，從調(diào)節(jié)ECM合成與降解平衡方面進(jìn)行肝纖維化的防治可獲得較好療效。柔肝化纖顆粒是在已故全國(guó)名老中醫(yī)林沛湘教授治療慢性肝炎、肝炎肝硬化有效驗(yàn)方組方(壯肝逐瘀煎)基礎(chǔ)上經(jīng)模糊數(shù)學(xué)優(yōu)化而成，經(jīng)過(guò)多年臨床實(shí)踐其有效性毋庸置疑[2]?，F(xiàn)觀察柔肝化纖顆粒對(duì)肝纖維化大鼠肝臟MMP-2和TIMP-2蛋白分布及表達(dá)的影響，為闡明其抗肝纖維化作用的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.3 觀測(cè)項(xiàng)目 各組于用藥治療后5周、10周，禁食12 h，隨機(jī)選取8只大鼠稱體質(zhì)量，經(jīng)1%戊巴比妥麻醉，股靜脈采血(血清于-70℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)錂z測(cè))，而后處死剖取肝臟，取肝臟右葉相同部位組織1塊置入10%甲醛中，作常規(guī)石蠟切片，將余下肝臟于液氮中速凍，-196℃保存，以備肝組織勻漿測(cè)Hyp(羥脯氨酸)、提取mRNA及RT-PCR分析用。肝組織切片免疫組織化學(xué)染色及計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)檢測(cè)IV膠原、MMP-2及TIMP-2。采用半定量RT-PCR法分析肝組織MMP-2、TIMP-2 mRNA的表達(dá)差異。取PCR產(chǎn)物和PCR Markers各10μl，加緩沖液，瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外透射反射分析儀下觀察并攝像，圖像分析軟件分析電泳條帶的面積和光密度，以平均值代表相應(yīng)基因的表達(dá)量，并除以相應(yīng)β-actin的mRNA平均值，即為MMP-2及TIMP-2的相對(duì)表達(dá)量。肝組織病理學(xué)觀察及肝纖維化程度半定量檢測(cè)參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 肝組織炎性反應(yīng)活動(dòng)度和肝纖維化變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死大鼠為有效動(dòng)物，B組大鼠肝組織炎性反應(yīng)活動(dòng)度計(jì)分、肝纖維化程度計(jì)分均較A組升高(P<0.05)；與B組比較，治療后C、D、E組大鼠肝組織炎性反應(yīng)活動(dòng)度、肝纖維化程度計(jì)分均明顯降低(P<0.05)；與C組比較，D、E組2指標(biāo)升高(P<0.05)；D、E組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠各時(shí)間段肝組織炎性反應(yīng)活動(dòng)度及肝纖維化程度計(jì)分

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05

2.2 肝組織內(nèi)MMP-2、TIMP-2變化 與A組比較，B組MMP-2、TIMP-2、 MMP-2/TIMP-2水平明顯升高(P<0.05)；與B組比較，治療后C、D、E組上述3項(xiàng)指標(biāo)降低(P<0.05)；與C組比較，D、E組上述3項(xiàng)指標(biāo)增高(P<0.05)，而D、E組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠各時(shí)間段肝組織內(nèi)MMP-2、TIMP-2表達(dá)水平變化

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05

3 討 論

總之，柔肝化纖顆粒能明顯降低CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟MMP-2、TIMP-2的表達(dá)，維持MMP-2/TIMP-2之間的平衡，一方面降低MMP-2有助于減少基底膜破壞、維持肝臟組織正常結(jié)構(gòu)和功能，另一方面TIMP-2表達(dá)減少有利于減少對(duì)MMP的抑制，從而促進(jìn)ECM降解、防治肝纖維化。此外，我們的前期研究還發(fā)現(xiàn)其具有減少肝組織激活素A(ACTA)表達(dá)、提高血清卵泡抑素(FS)水平[15，16]的作用，從而減少肝細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝細(xì)胞再生，說(shuō)明柔肝化纖顆粒抗肝纖維化的作用機(jī)制可能是多方面的，這為其臨床應(yīng)用提供了有力的理論依據(jù)。

1 Roy SC,Ghosh J.Dynamic in vivo changes in the activities of gelatinases,matrix metalloproteinases(MMPs),andtissue inhibitor of metalloproteinases(TIMPs) in buffalo(Bubalus bubalis)uterine luminal fluidduring estrous cycle andearly pregnancy[J].Mol ReprodDev,2010,77(11):944-953.

2 楊刪，王婷，王振常.柔肝化纖顆粒對(duì)肝纖維化大鼠FS表達(dá)的影響[J].廣西中醫(yī)藥，2011,34(4)：55-57.

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EffectsofRouganhuaxianparticleonMMP-2andTIMP-2inratsmodelofliverfibrosisinducedbyCCl4

WANGZhenchang*,YANGShan,HUANGJingjing,LVJianlin.

*LiverCenter,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Guangxi,Nanning530023,China

ObjectiveTo investigate the effects ofRouganhuaxianparticle on MMP-2 andTIMP-2 in rats model of liver fibrosis inducedby CCl4.MethodsSelect healthy andclean SPF level rats (n=78), they were randomly dividedinto normal control group (A group), pathological model group (B group),Rouganhuaxianparticle group (C group),Dahuangzhechongpill group (dgroup) andcolchicine control group (E group), the latter four groups were establishedCCl4-inducedliver fibrosis in rats, andthen were given saline,Rouganhuaxianparticles,Dahuangzhechongpills, colchicine gavage for 5 weeks and10weeks, respectively, after taking rat liver tissue, using immunohistochemical staining andcomputer image analysis to detect MMP-2 andTIMP-2.ResultsTreatment for 5 weeks, 10weeks comparedwith group A,B group liver inflammation activity meter points, liver fibrosis scores were significantly higher (P<0.05), C, D, E group was significantly lower than group B(P<0.05), where C group was significantly decreasedcomparedwith D, E group(P<0.05), while no statistically significant difference between the groups D, E (P>0.05);andcomparedwith A group, B group MMP-2, TIMP-2, MMP-2/TIMP-2 were significantly higher(P<0.05); comparedwith group B,group C, D, E MMP-2, TIMP-2 expression andMMP-2/TIMP-2 significantly decreased(P<0.05), C group decreasedmore obvious comparedwith D, E groups (P<0.05), while no statistically significant difference between the groups D, E (P>0.05).ConclusionRouganhuaxianparticle can prevent andcure liver fibrosis through regulate the ratio of MMP-2/TIMP-2.

Rouganhuaxianparticle; Liver fibrosis; MMP-2; TIMP-2；Rats

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2010GXNSFA013211)

530023 南寧，廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病中心(王振常、黃晶晶、呂健林)，530007 廣西中醫(yī)醫(yī)藥大學(xué)(楊刪)

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.01.026

2013-09-18)