石秋艷，張瑞彪，田廣平

論著·基礎(chǔ)

不同劑量阿托伐他汀鈣對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓內(nèi)NF-κB表達(dá)及血清炎性因子的影響

石秋艷，張瑞彪，田廣平

目的探討不同劑量阿托伐他汀鈣對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠脊髓內(nèi)NF-κB表達(dá)及血清炎性因子的影響。方法82只Wistar大鼠隨機(jī)抽取10只為健康對照組，余72只以50%豚鼠全脊髓勻漿誘發(fā)建立EAE 模型，而后隨機(jī)分為EAE模型組、大劑量阿托伐他汀組(大劑量組)、小劑量阿托伐他汀組(小劑量組)各24只，采用量化評分法，比較造模后14d、21d不同劑量阿托伐他汀鈣對 EAE大鼠血清白介素-2(IL-2)、同型半胱氨酸(Hcy)及脊髓內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)水平的影響，同時(shí)對其發(fā)病率及潛伏期進(jìn)行比較。結(jié)果造模后高劑量組發(fā)病率及病死率明顯低于低劑量組及EAE模型組，14d及21d時(shí)神經(jīng)功能評分均低于低劑量組及EAE模型組(P<0.05)，而低劑量組與EAE模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后14d及21d，EAE模型組血清IL-2、Hcy水平及脊髓NF-kB陽性表達(dá)水平均較健康對照組升高(P<0.05)，高劑量組低于低劑量組與EAE模型組(P<0.05)，而低劑量組與EAE模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。21d時(shí)，高劑量組、低劑量組、EAE模型組上述各項(xiàng)指標(biāo)均較14d時(shí)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論高劑量阿托伐他汀鈣能降低大鼠EAE的發(fā)病率及病情嚴(yán)重程度，可能與其抗炎及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。

腦脊髓炎，自身免疫性，實(shí)驗(yàn)性；NF-κB；炎性因子；阿托伐他汀鈣；大鼠

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)于1868 年由法國醫(yī)生 Charcot首次提出，至今仍是整個(gè)醫(yī)學(xué)界未解的難題之一。MS 的主要病理特征為自身免疫炎性反應(yīng)所致的髓鞘脫失和軸突損傷等，特別是在發(fā)病早期發(fā)生的軸突變性及神經(jīng)元損傷是 MS 患者神經(jīng)功能障礙的重要原因。現(xiàn)就阿托伐他汀鈣對MS的經(jīng)典動(dòng)物模型——實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE) 脊髓內(nèi)NF-κB表達(dá)及血清炎性因子水平影響的觀測，探討 MS 的發(fā)病機(jī)制，尋求針對 MS 有效的治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性Wistar大鼠82只， 7～8周齡，體質(zhì)量160～200g，清潔級，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。豚鼠10只，雌雄各半，24～36周齡，體質(zhì)量360～380g，清潔級，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試劑：白介素-2(IL-2)、同型半胱氨酸(Hcy)試劑盒購自上海天呈生物技術(shù)有限公司。兔抗大鼠NF-κB 抗體及二步免疫組化檢測試劑盒購于北京博奧森生物技術(shù)公司。完全福氏佐劑購于美國 Sigma 公司；卡介苗購于北京生物制品研究所；阿托伐他汀鈣由大連輝瑞制藥有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 豚鼠全脊髓勻漿參照文獻(xiàn)[1]方法制備，經(jīng)10%水合氯醛3～5 ml腹腔注射麻醉處死后，冰上迅速剝除脊膜，取出脊髓，按1∶1比例加入等量0.9%氯化鈉用超聲細(xì)胞粉碎儀在冰槽中制成50%的全脊髓勻漿，與等量含0.4g/100ml卡介苗的完全福氏佐劑混合充分至油包水乳劑；隨機(jī)抽取10只大鼠作為健康對照組，其余大鼠經(jīng)上述試劑乳化后按0.8 ml/只4h內(nèi)注射于大鼠雙后足墊內(nèi)皮下誘導(dǎo)建立EAE模型，并隨機(jī)分成3組，即EAE模型組、低劑量阿托伐他汀組(低劑量組)、高劑量阿托伐他汀組(高劑量組)，每組24只，免疫后當(dāng)日高劑量組予阿托伐他汀鈣8 mg/kg 灌胃治療，低劑量組予阿托伐他汀鈣3mg/kg 灌胃治療，EAE模型組及健康對照組給予生理鹽水灌胃，每日1次持續(xù)至動(dòng)物處死。5分評分法評分≥1分為造模成功。大鼠于造模成功后第14、21天以10%水合氯醛3～5 ml腹腔麻醉后每組各取12只斷頭處死，取脊髓，常規(guī)石蠟封片包埋，每25 μm間斷性連續(xù)切片，同時(shí)予以常規(guī)HE染色；同時(shí)心臟采血2 ml，離心后獲取血清，-70℃冰箱保存。

1.3 觀測指標(biāo)

1.3.1 動(dòng)物行為學(xué)觀察和神經(jīng)癥狀評分：觀察大鼠臨床表現(xiàn)及行為。模型評分采用5分評分法：1分：動(dòng)物尾部無力下垂或無力挺立；2分：后肢無力；3分：后肢癱瘓；4分：四肢癱瘓；5分：瀕死狀態(tài)或死亡。

1.3.2 血清炎性因子水平及NF-κB陽性表達(dá)情況：血清IL-2、Hcy測定采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法。試劑盒購自上海天呈生物技術(shù)有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行測定。NF-κB陽性細(xì)胞采用免疫組化法檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，同時(shí)設(shè)陰性對照。取大鼠腰髓切片在顯微鏡下計(jì)數(shù)每張片內(nèi)隨機(jī)5個(gè)高倍視野(×400) NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)，NF-κB的表達(dá)以該片陽性細(xì)胞數(shù)總和/5表示，取10片平均值。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物發(fā)病情況及神經(jīng)癥狀評分 健康對照組大鼠無發(fā)病，活動(dòng)度正常。其余3組8～15 d發(fā)病，發(fā)病后3～8 d可有緩解，部分癥狀持續(xù)進(jìn)展，少數(shù)緩解后復(fù)發(fā)，部分大鼠死亡。各組比較，高劑量組發(fā)病率及病死率明顯低于低劑量組及EAE模型組(P均<0.05)，同日神經(jīng)功能評分明顯低于低劑量組及EAE模型組(P均<0.05)，而發(fā)病率、病死率及神經(jīng)功能評分低劑量組與EAE模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。見表1。

2.2 血清炎性因子水平及NF-κB陽性表達(dá)情況比較 免疫大鼠發(fā)病后14～21d血清IL-2及Hcy均高于健康對照組(P<0.05)，發(fā)病21d后上述炎性因子較14d時(shí)有所降低(P均<0.05)，其中2個(gè)時(shí)間段高劑量組均低于低劑量組及EAE模型組(P均<0.05)。大鼠于免疫14d后NF-κB 陽性細(xì)胞明顯增多，呈彌漫性分布，多見于白質(zhì)、灰白質(zhì)交界處及血管“袖套”處，隨著病程的延長，到21d陽性細(xì)胞數(shù)又逐漸減少(P<0.05)(圖1、2見封3)。高劑量組大鼠在免疫后14d和21d，NF-κB 細(xì)胞數(shù)明顯低于EAE模型組及低劑量組(P均<0.05)。而低劑量組與EAE模型組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組Wistar大鼠 EAE發(fā)病情況及其神經(jīng)癥狀評分

注：與EAE模型組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05

表2 各組Wistar大鼠不同時(shí)間段血清炎性因子水平及NF-κB表達(dá)情況

注：與健康對照組比較,*P<0.05；與EAE模型組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05；與14d比較,☆P<0.05

3 討 論

MS是一類主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，T細(xì)胞針對中樞神經(jīng)髓鞘成分的抗原抗體反應(yīng)在MS的發(fā)病過程中起到了關(guān)鍵的作用。其主要發(fā)病機(jī)制是某種外部因素作用下激活的T細(xì)胞透過血腦屏障進(jìn)入到腦組織，結(jié)合中樞的抗原形成細(xì)胞抗原，再刺激T細(xì)胞分泌出大量的炎性細(xì)胞因子，促使B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化，進(jìn)一步使外周血中的T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞以及B淋巴細(xì)胞等進(jìn)入到炎性反應(yīng)部位，從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)軸索的損害以及神經(jīng)組織的炎性脫髓鞘反應(yīng)[2]。在這些炎性細(xì)胞因子中，比較有代表性的是白介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)及同型半胱氨酸(Hcy)等，目前研究證實(shí) Hcy作為炎性細(xì)胞因子，不但與動(dòng)脈硬化密切相關(guān)，而且嚴(yán)重影響著患者的認(rèn)知功能[3，4]。意大利精神病學(xué)家對一個(gè)大樣本健康老年人的研究發(fā)現(xiàn)，隨著Hcy水平的升高，簡易精神狀況檢查評分逐漸降低，Hcy成為認(rèn)知功能損害的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5]，而IL-2是T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)中重要一環(huán)，由Th1類細(xì)胞分泌，在炎性反應(yīng)啟動(dòng)過程中有著至關(guān)重要作用，因此，我們從中挑選IL-2及Hcy作為其中代表性的因子，探討這些炎性因子在多發(fā)性硬化發(fā)病過程中的水平變化。同時(shí)探討阿托伐他汀鈣對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及對血清炎性因子水平的影響。

凌振芬等[6]研究證明，抗氧化藥物α硫辛酸能顯著改善EAE大鼠的神經(jīng)功能，其機(jī)制可能與抗炎及免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。歷芳等[7]研究表明，阿米洛利能夠減緩小鼠EAE病情，其機(jī)制可能與下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)IL-17和IFN的表達(dá)，上調(diào)IL-10的表達(dá)有關(guān)。近年來關(guān)于他汀類藥物抗炎及抗氧化的作用日益受到醫(yī)學(xué)界的重視[8]，同時(shí)，其對于多發(fā)性硬化的干預(yù)作用時(shí)見報(bào)道[9～11]。阿托伐他汀作為他汀類藥物中最有效的調(diào)脂藥物之一，能有效地控制動(dòng)脈硬化斑塊的形成及進(jìn)展，并能使不穩(wěn)定斑塊轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定性斑塊。近年來發(fā)現(xiàn)它具有抗炎及雙向免疫調(diào)節(jié)作用，他汀類藥物的抗炎作用可能是通過抑制 HMG-CoA還原酶，阻斷類異戊二烯中間代謝產(chǎn)物的生成，進(jìn)而阻斷Ras、Rho、Rac 等蛋白的異戊二烯化，調(diào)節(jié) Thl /Th2平衡，影響細(xì)胞的增殖、分化和遷移作用[12]。Neuhaus 等[13]研究證實(shí)，他汀類藥物可劑量依賴性地抑制活化 T 細(xì)胞的增殖，減少 T細(xì)胞上黏附分子的表達(dá)，有效下調(diào) B 細(xì)胞、T 細(xì)胞上趨化因子受體。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量組與低劑量組及 EAE模型組相比MS發(fā)病日期后延，神經(jīng)系統(tǒng)評分有明顯下降，病理檢查所示病灶數(shù)也顯著減少，同時(shí)血清炎性因子水平明顯降低，顯示高劑量阿托伐他汀具有干預(yù)治療大鼠 EAE 的作用。造模成功大鼠于14d后脊髓內(nèi) NF-κB陽性細(xì)胞大量活化，而高劑量組NF-κB 陽性細(xì)胞明顯減少，其臨床癥狀也較 EAE模型組及低劑量組減輕，這說明了阿托伐他汀可能抑制了 NF-κB 陽性細(xì)胞增殖活化，從而減輕了炎性反應(yīng)。NF-κB 作為一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子，具有多種功能，其在炎性反應(yīng)中起重要作用。他汀類藥物通過抑制Th0細(xì)胞向 Thl 細(xì)胞分化，減少 Thl 類細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ等) 的分泌，同時(shí)增加Th2類因子(IL-4、IL5、IL10等)的分泌，雙向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[14]，因此利于疾病的恢復(fù)。有研究證明[15]，阿托伐他汀促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，進(jìn)而產(chǎn)生多種抗炎性細(xì)胞因子，通過這些抗炎因子的保護(hù)作用，能有效減低神經(jīng)髓鞘的損傷，從而減輕臨床癥狀，有利于 EAE 的恢復(fù)。因此，筆者認(rèn)為阿托伐他汀減輕 EAE 的臨床癥狀和病理改變，可能與其對于血清炎性因子水平的影響，即抗炎作用有關(guān)。

總之，阿托伐他汀可降低大鼠脊髓內(nèi) NF-κB 陽性細(xì)胞數(shù)及血清IL-2、Hcy等炎性因子水平，提示抗炎治療在EAE治療中的重要作用，為尋求更有效治療多發(fā)性硬化的藥物開辟了新的路徑。

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2 吳彥青，高穎，朱陵群.實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中樞神經(jīng)組織中ZO-1mRNA的變化及益腎達(dá)絡(luò)飲對其的影響[J].中國中醫(yī)急癥,2012，21(12)：1936-1938.

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7 厲芳，鄭榮遠(yuǎn)，張正學(xué).阿米洛利對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞因子表達(dá)的影響[J].中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2012，20(2)：121-125.

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12 Beutler B． Inferences，questions andpossibilities in Toll-like recep-tor signaling[J]． Nature，2004，430(6996): 257-263.

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InfluenceofatorvastatincalciumontheexpressionofspinalcordNF-κBandseruminflammatoryfactorsinexperimentalautoimmuneencephalomyelitisrats

SHIQiuyan*,ZHANGRuibiao,TIANGuangping.

*DepartmentofSevereNeurology,AffiliatedHospitaltoHebeiUnionUniversity,Tangshan063000,China

ObjectiveTo detect the influence of different doses of atorvastatin calcium on spinal cordnuclear factor kappa B (NF-κB) expression andserum inflammatory factors levels in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) rats.MethodsTen of 82 Wistar rats were sampledas healthy control group,the other 72 rats were inducedEAE model by 50% guinea pig spinal cordhomogenate, then dividedinto EAE model group,high-dose atorvastatin group(high-dose group),low-dose atorvastatin group(low-dose group),with 24rats in each group, using quantitative evaluation methodcompareddifferent doses of atorvastatin calcium on serum inflammatory factors in rats with EAE,including interleukin -2(IL-2), homocysteine(Hcy) andNF-κB level of the spinal cord, andcomparedthe incidence andincubation period.ResultsAfter EAE model was established,the incidence andmortality rate of high-dose group was obviously lower than low-dose group andEAE group,andthe neural function score was lower than low-dose group andEAE group at 14dand21d(P<0.05),but there was no difference between low-dose group andEAE group (P>0.05). 14dand21dafter modeling,the serum IL-2,Hcy andspinal cordNF-κB expression level in EAE group were elevatedthan healty control group(P<0.05),high-dose group was lower than low-dose group andEAE group(P<0.05), but there was no difference between low-dose group andEAE group(P>0.05).Comparedwith 14d,all above indexes in high-dose group,low-dose group andEAE group in 21dwere obviously declined(P<0.05).ConclusionHigh-dose atorvastatin calcium can reduce the incidence andseverity of EAE rats,it may be relatedto anti-inflammatory andimmune regulation mechanism.

Encephalomyelitis,autoimmune,experimental；Nuclear factor kappa B；Inflammatory factors；Atorvastatin calcium;Rats

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目計(jì)劃(No.20100473)

063000 唐山，河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院重癥神經(jīng)科(石秋艷)；063200 唐山市曹妃甸區(qū)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)分泌科(張瑞彪)； 066600 昌黎，秦皇島市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(田廣平)

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.01.025

2013-09-10)