蔣友旭 張麗華 王小曼 李盼盼

普伐他汀對(duì)大鼠急性心肌梗死后熱休克蛋白B7表達(dá)的影響*

蔣友旭 張麗華△王小曼 李盼盼

目的觀(guān)察急性心肌梗死（AMI）大鼠梗死區(qū)心肌組織中熱休克蛋白B7（HSPB7）mRNA和蛋白的表達(dá)水平，研究普伐他汀對(duì)HSPB7表達(dá)的干預(yù)作用。方法80只AMI大鼠隨機(jī)分為AMI組和普伐他汀（P）組，每組40只，同時(shí)設(shè)假手術(shù)（SH）組大鼠40只，再將3組大鼠分為1、3、6和12 h組，每個(gè)時(shí)間組10只。SH組開(kāi)胸后不結(jié)扎冠脈；AMI組開(kāi)胸后結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支；P組開(kāi)胸后結(jié)扎冠狀左前降支，同時(shí)給予普伐他汀0.5 mg/（kg·d）灌胃；其余組給予等量蒸餾水灌胃。分別于各時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，取左心室梗死區(qū)心肌組織，SH組取對(duì)應(yīng)部位的心肌組織，分別采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫組化法檢測(cè)HSPB7 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果AMI組和P組大鼠各時(shí)點(diǎn)梗死區(qū)心肌組織HSPB7 mRNA和蛋白表達(dá)均高于SH組（P＜0.01）；梗死后1 h，梗死區(qū)心肌HSPB7 mRNA和蛋白的表達(dá)增加，在3 h時(shí)達(dá)到高峰，6 h組、12 h組HSPB7 mRNA和蛋白的表達(dá)仍高于SH組。且P組中各時(shí)間點(diǎn)HSPB7的表達(dá)高于AMI組。結(jié)論HSPB7能夠在AMI早期表達(dá)，普伐他汀可促進(jìn)AMI后梗死區(qū)心肌組織HSPB7表達(dá)，可能是其在心梗早期起到保護(hù)心肌作用的機(jī)制之一。

熱休克蛋白質(zhì)類(lèi)；普伐他丁；心肌梗死；急性??；疾病模型,動(dòng)物；熱休克蛋白B7

急性心肌梗死（AMI）是冠心病的嚴(yán)重類(lèi)型，近年來(lái)發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，且是心源性猝死的主要原因之一。AMI主要是由于易損斑塊破裂和血栓形成所致，其中炎癥反應(yīng)起重要作用。AMI起病急、病情重、變化快、并發(fā)癥多，因此早期對(duì)AMI患者進(jìn)行干預(yù)和治療顯得尤為重要。熱休克蛋白B7（HSPB7）作為一種小分子蛋白質(zhì)，只特異性地在心肌細(xì)胞中表達(dá)[1]，在心肌細(xì)胞受損早期起到保護(hù)作用。近年來(lái)偶見(jiàn)HSPB7與心力衰竭相關(guān)性的研究，但是其在AMI后表達(dá)的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠AMI模型，觀(guān)察心肌梗死后心肌組織中HSPB7表達(dá)的變化及普伐他汀對(duì)其影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康清潔級(jí)SD大鼠120只，體質(zhì)量250～300 g（鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。普伐他汀鈉片（20 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字H20040100），兔抗大鼠HSPB7多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司，HSPB7和β-actin（內(nèi)參）引物、總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。小動(dòng)物呼吸機(jī)（HX-300S，成都泰盟科技有限公司）。圖像采集：德國(guó)Lecia顯微照像系統(tǒng)。Biosens Digital Imaging System v1.6分析系統(tǒng)（上海山富科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠AMI模型的制備及分組 SD大鼠用100 g/L水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后仰臥位固定，氣管插管并連接標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)心電圖。于胸骨左緣外3～4肋間觸及心臟搏動(dòng)最強(qiáng)處縱行切開(kāi)皮膚，止血鉗依次分離各層組織至肋骨，連接并打開(kāi)呼吸機(jī)后觀(guān)察到大鼠機(jī)械呼吸后，打開(kāi)胸腔，充分暴露心臟，在左心耳和肺動(dòng)脈錐間距主動(dòng)脈根部約2～3 mm處用6.0無(wú)創(chuàng)傷縫線(xiàn)穿過(guò)冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）并結(jié)扎。結(jié)扎后，前壁心肌組織顏色由鮮紅迅速變?yōu)榘导t，隨后逐漸變?yōu)榘咨?，心電圖監(jiān)測(cè)Ⅰ和avL導(dǎo)聯(lián)ST段較前上抬＞0.2 mV表示手術(shù)成功。關(guān)閉胸腔后逐層縫合組織，待大鼠出現(xiàn)自主呼吸拔出氣管插管。術(shù)后將存活的80只AMI大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為AMI組和普伐他?。≒）組，再將上述2組隨機(jī)分為1、3、6和12 h組，每組10只。假手術(shù)（SH）組于相同部位穿過(guò)縫合線(xiàn)，不結(jié)扎，余操作同AMI各組。術(shù)后存活的SH組大鼠隨機(jī)分為上述4個(gè)時(shí)間組，每組10只，共40只。普伐他汀組給予普伐他汀0.5 mg/（kg·d），于術(shù)后立即灌胃；其余各組給予等量生理鹽水。

1.2.2 心臟標(biāo)本的提取及處理 分別于術(shù)后1、3、6和12 h處死大鼠，迅速取出心臟，生理鹽水沖洗后取左心室前壁心梗區(qū)組織作為標(biāo)本。

1.2.3 HSPB7蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組化SP方法，按照試劑盒說(shuō)明操作，DAB顯色。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。顯微鏡下觀(guān)察棕黃色顆粒為HSPB7陽(yáng)性表達(dá)，每張切片隨機(jī)讀取5個(gè)視野（400倍）進(jìn)行圖像采集。應(yīng)用Biosens Digital Imaging System v1.6對(duì)所采集照片的免疫組化染色的平均光密度（OD）值進(jìn)行測(cè)量，用平均光密度×選定對(duì)象的面積計(jì)算積分光密度（IOD），重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 HSPB7 mRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法。取心肌標(biāo)本組織約100 mg，加入液氮完全研碎。按試劑盒說(shuō)明提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。上游引物為 5′-CAGAGGACTTTGGCAGTTTCA-3′，下游引物為 5′-GATGTGGTTGTTGGAGGTGGT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為170 bp；β-actin上游引物為5′-CCCATCTATGAGGGTTAC-3′，下游引物為5′-GGAAGGTGGACAGTGAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為 568 bp。PCR擴(kuò)增體系：取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，上、下游引物各1 μL，酶緩沖液5 μL，dNTPs 4 μL，Taq 酶 0.5 μL，補(bǔ)水到50 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃總延伸6 min。取PCR產(chǎn)物，用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像，Quantity One軟件分析后計(jì)算HSPB7與β-actin灰度值的比值代表其相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HSPB7免疫組化結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色示，SH組可見(jiàn)微量的棕黃色顆粒沉著，主要分布于細(xì)胞周邊；AMI組可見(jiàn)大量壞死心肌細(xì)胞，并有中等量棕黃色顆粒，周邊和中央均有分布；P組切片可見(jiàn)一定量壞死細(xì)胞，大量的棕黃色顆粒，主要分布于細(xì)胞中央，見(jiàn)圖1。與SH組相比，AMI組和P組各時(shí)間點(diǎn)HSPB7蛋白表達(dá)均明顯增加，且P組高于AMI組（均P＜0.01），見(jiàn)表1。

Table 1 Comparison of the positive gray area of HSPB7 protein between three groups表1 各組HSPB7蛋白陽(yáng)性區(qū)灰度值比較（n=10，IOD，ˉ±s）

Table 1 Comparison of the positive gray area of HSPB7 protein between three groups表1 各組HSPB7蛋白陽(yáng)性區(qū)灰度值比較（n=10，IOD，ˉ±s）

＊＊P＜0.01；a與SH組比較，b與AMI組比較，P ＜ 0.01;表2同

組別SH組AMI組P組F 1 h 95.58±1.55 125.46±1.77a130.60±2.23ab105.602＊＊3 h 94.69±1.73 132.05±1.96a173.17±1.53ab511.231＊＊6 h 95.04±1.32 119.96±1.95a131.74±1.24ab110.604＊＊12 h 94.15±1.59 109.26±1.24a118.51±1.55ab64.548＊＊

2.2 HSPB7 RT-PCR結(jié)果 與SH組比較，AMI組和P組HSPB7 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，P組高于AMI組（均P ＜ 0.01），見(jiàn)表2、圖2。

Table 2 Comparison of the expression of HSPB7 mRNA between three groups表2 各組HSPB7 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，ˉ±s）

Table 2 Comparison of the expression of HSPB7 mRNA between three groups表2 各組HSPB7 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，ˉ±s）

組別SH組AMI組P組F 1 h 0.11±0.02 0.36±0.02a0.43±0.02ab844.620＊＊3 h 0.11±0.02 0.65±0.02a0.83±0.02ab3 446.024＊＊6 h 0.11±0.02 0.25±0.01a0.33±0.01ab529.992＊＊12 h 0.12±0.03 0.17±0.01a0.22±0.01ab170.005＊＊

Figure 2 The expression of HSPB7 mRNA detected by RT-PCR圖2RT-PCR檢測(cè)HSPB7 mRNA的表達(dá)

3 討論

3.1 HSPB7及普伐他汀在AMI時(shí)的作用機(jī)制 AMI主要是由于冠狀動(dòng)脈內(nèi)形成閉塞，使心肌嚴(yán)重而持久地缺血缺氧，導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死、凋亡。AMI時(shí)心肌細(xì)胞缺血缺氧能夠啟動(dòng)熱休克反應(yīng)，小分子熱休克蛋白家族（sHSP）是人體在發(fā)生熱休克反應(yīng)時(shí)的主要產(chǎn)物，sHSP的過(guò)度表達(dá)能夠促進(jìn)缺血缺氧的心肌細(xì)胞快速?gòu)?fù)氧[2]，并且通過(guò)抑制應(yīng)激活化蛋白激酶、半胱氨酸蛋白酶活性的表達(dá)[3]，阻止心肌細(xì)胞的凋亡和壞死[4-5]。HSPB7是sHSP家族成員之一，Chiu等[6]已經(jīng)證實(shí)在無(wú)胸痛癥狀的早期心肌梗死患者血漿中能夠檢測(cè)出HSPB7的表達(dá)。HSPB7是在阻止細(xì)胞壞死過(guò)程中表達(dá)最為活躍的小分子蛋白質(zhì)[7]，它能夠阻止多聚谷氨酰胺（PolyQ）蛋白低聚化和形成聚合物，降低PolyQ的毒性，從而防止心肌細(xì)胞的凋亡[8]。在AMI時(shí)，心肌組織中的HSPB7能夠從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中轉(zhuǎn)位到肌原纖維的Z帶或者I帶上，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合，參與細(xì)胞骨架的穩(wěn)定[9]，因此HSPB7可以在應(yīng)激的情況下阻止變性的細(xì)胞骨架蛋白重新折疊，從而起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。AMI過(guò)程中的另一重要改變是急性炎癥反應(yīng)，已有研究表明炎癥反應(yīng)在AMI的形成和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[10]。普伐他汀為第3代他汀類(lèi)藥物，在降低血脂、穩(wěn)定斑塊方面起重要作用。近年來(lái)關(guān)于普伐他汀在急性炎癥反應(yīng)過(guò)程中的作用成為熱點(diǎn)。Bustos研究小組證實(shí)普伐他汀能夠在早期細(xì)胞受損的3～5 h內(nèi)參與炎癥反應(yīng)過(guò)程，誘導(dǎo)sHSP大量表達(dá)，sHSP可作用于多種炎性細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞聚集和抑制炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附等一系列反應(yīng)來(lái)達(dá)到其抗炎的作用[11]。

3.2 HSPB7在AMI模型的表達(dá)及普伐他汀對(duì)其表達(dá)的影響 本研究顯示，AMI后HSPB7表達(dá)增加，并且在普伐他汀的作用下刺激HSPB7大量表達(dá)，可能是普伐他汀在AMI過(guò)程中保護(hù)心肌細(xì)胞的機(jī)制之一。在不同時(shí)間點(diǎn)觀(guān)察，與SH組相比，AMI組和P組梗死后1 h，梗死區(qū)心肌HSPB7 mRNA和蛋白的表達(dá)即可升高，在3 h時(shí)達(dá)到高峰，6 h組、12 h組mRNA和蛋白的表達(dá)仍高于SH組，提示HSPB7能夠在AMI早期迅速表達(dá)，在癥反應(yīng)的早期即可通過(guò)提高心肌細(xì)胞的抗氧化能力，穩(wěn)定細(xì)胞骨架，抵抗缺血再灌注所帶來(lái)的損傷，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞凋亡起到一定的阻止作用。

綜上所述，本研究初步表明，HSPB7能夠在AMI早期表達(dá)，普伐他汀可促進(jìn)AMI后梗死區(qū)心肌組織HSPB7表達(dá)。在AMI的早期進(jìn)行HSPB7水平的檢測(cè)并服用他汀類(lèi)藥物可能為AMI的早期診治提供新的思路，值得進(jìn)一步研究。

Figure1 The expression of HSPB7 protein detected by immunohistochemistry（SP,×400）圖1 HSPB7蛋白免疫組化染色結(jié)果（SP,×400）

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（2013-05-06收稿 2013-09-22修回）

（本文編輯 李鵬）

The Effect of Pravastatin on the Expression of HSPB7 in Acute Myocardial Infarction Rats

JIANG Youxu,ZHANG Lihua,WANG Xiaoman,LI Panpan
Department of Cardiology,The Second Affiliated Hospital，Zhengzhou University,Zhengzhou 450014，China

ObjectiveTo observe the effect of pravastatin on the expression of heat shock protein B7(HSPB7)in acute myocardial infarction(AMI)rats.MethodsA total of 80 AMI rats were randomly divided into AMI group and pravastatin(P)group.Forty SD rats were used as sham operation(SH)group.Rats were then subdivided into 1 h,3 h,6 h and 12 h subgroups(10 for each group).Rats were not ligated after thoracotomy in SH group.The 1eft anterior descending coronary artery was ligated in rats of AMI group.The 1eft anterior descending coronary artery was ligated in P group and given intragastric administration of 0.5 mg/(kg·d)pravastatin.The other groups were given the same amount of normal saline via gavage.The left ventricle infarcted myocardial tissues were taken at each time intervals.The corresponding myocardial tissues were harvested in sham-operated rats.The HSPB7 mRNA and protein expressions were measured by RT-PCR and immunohistochemistry respectively．ResultsThe expression levels of HSPB7 mRNA and protein were significantly higher in the AMI group and P group than those of SH group(P＜0.01).The expression levels of HSPB7 mRNA and protein were significantly increased 1 h after AMI and reached the peak value at 3 h after AMI.The expression levels of HSPB7 mRNA and protein were still higher in 6-h group and 12-h group than those of SH group.The expression levels of HSPB7 were higher in different time points of P group than those of AMI group.ConclusionHSPB7 could express in the early stage of acute myocardial infarction in rats.Pravastatin could promote the upregulation of HSPB7 in myocardial infarcted border zone after AMI，which may play a protective role in early myocardial infarction.

heat-shock proteins ；pravastatin；myocardial infarction；acute disease；disease models,animal；HSPB7 protein

R542.2 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.011

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：201204029）

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科（郵編450014）

△通訊作者 E-mail：zlhxp@126.com