李小倩 馮潤荷 李 靜 唐向東

過氧化氫對游離線粒體Cyt-c釋放的影響*

李小倩1馮潤荷2△李 靜1唐向東1

目的在線粒體水平探討過氧化氫（H2O2）預處理對游離線粒體細胞色素c（Cyt-c）釋放的影響，揭示缺血預適應（IPC）對缺血再灌注（IR）損傷的作用機制。方法分離大鼠肝臟線粒體，制成游離線粒體。將游離線粒體分為5組，（1）為對照（C）組、（2）～（5）組分別加入12.5、25、50和100 μmol/L的Ca2+，刺激游離線粒體10 min，檢測游離線粒體Cyt-c，胱氨酸酶激活劑（Smac）的釋放量。建立游離線粒體IPC再灌注模型，將游離線粒體分為7組，C組、IR組、加H2O2組共7組，對加H2O2組分別加入2 μL H2O2，終濃度分別為1、2、5、20和100 μmol/L；在H2O2處理后，再用100μmol/L Ca2+對IR組、加H2O2組模擬再灌注，檢測Cyt-c的釋放量，再對IR組和H2O2終濃度為1和2μmol/L組檢測心磷脂活性的變化。結果與C組比較，Ca2+濃度25、50和100μmol/L組Cyt-c、Smac的釋放量顯著增高（P＜0.05）。與IR組比較，H2O2濃度1、2μmol/L組Cyt-c的釋放量明顯減少（P＜0.05）。Cyt-c釋放減少時可改變心磷脂的活性。結論低濃度H2O2預處理通過使Cyt-c與心磷脂結合得更加緊密，而使線粒體在高Ca2+（100μmol/L）刺激后Cyt-c釋放量減少，阻滯了凋亡途徑的發(fā)生，是IPC對缺血再灌注損傷發(fā)揮效應的關鍵因素。

過氧化氫；細胞色素c；再灌注損傷；鈣超載；線粒體通透性轉換孔

缺血預適應（IPC）是廣泛存在的內源性保護機制，存在于多種器官系統(tǒng)，如心臟、腦、肝臟和腎臟。雖然IPC現(xiàn)象已達到共識，但其確切機制尚不完全清楚，因而一直以來是缺血再灌注（IR）研究領域的一個熱點問題。細胞色素c（Cyt-c）[1]、胱氨酸酶激活劑（Smac）[2]等線粒體內容物釋放入胞漿而導致細胞凋亡是目前廣泛接受的IR損傷機制，而IPC對IR損傷的保護機制是否與Cyt-c、Smac的釋放有關尚不清楚。有研究表明，小劑量過氧化氫（H2O2）預處理能夠減輕線粒體Ca2+超載，減少線粒體內膜通透性轉換孔（mPTP）的開放，從而對IR損傷發(fā)揮保護作用[3]，但對相關機制爭論頗多。本研究從線粒體水平探討H2O2預處理對Cyt-c、Smac等釋放的影響，旨在揭示IPC對IR損傷的作用機制，為臨床預防IR損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 雄性SD大鼠，SPF級，體質量（250±30）g，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。主要試劑H2O2、Mannitol、Sucrose、乙二醇雙四乙酸（EGTA）、KH2PO4、十二烷基硫酸鈉（SDS）、NaCl、Anti-Cyt-c、Smac購自Sigma-Aldrich，NAO為Invitrogen產品。電泳儀（Bio-Rad）、離心機TDL-5C型（上海安亭科學儀器廠）、流式細胞儀（BD FACSCalibur）、SW-CJ-2FB雙人兩用凈化工作臺（蘇州凈化）。

1.2 方法

1.2.1 線粒體分離 先將分離緩沖液（Mito I）放入-20℃的冰箱中冷凍30 min。麻醉大鼠，取適量新鮮肝臟，剪成1 cm3的小塊，立即在Mito I中預冷4～5 min。稱取適量肝臟組織（約0.142 g制成2.4 mL線粒體懸液），剪碎，研磨至無組織塊的渾濁液體。離心10 min（4℃，600×g）后棄沉淀，將上清再離心10 min（4 ℃，12 000×g），棄上清，沉淀即為線粒體。用適量線粒體懸浮液重懸線粒體，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高Ca2+刺激干預Cyt-c和Smac的釋放 Ca2+刺激實驗：將游離線粒體分為5組，（1）為對照（C）組、（2）～（5）組分別加入 12.5、25、50 和 100 μmol/L 的 Ca2+，刺激游離線粒體 10 min。將各組線粒體離心15 min（4 ℃，14 000×g），上清按適當比例與5×上樣緩沖液（loading buffer）混勻，沸水煮8 min，冰上冷卻后離心5 min（3 000 r/min，4℃），-20℃保存；沉淀用200 μL全細胞提取液（RIPA）打勻，冰上放置30 min，5 min震動一次，使裂解液與線粒體充分接觸，蛋白懸液按適當比例與5×loading buffer混勻，沸水煮8 min，冰上冷卻后離心5 min（3 000 r/min，4 ℃），-20 ℃保存。用Western blot方法[4]檢測上清液和線粒體內Cyt-c、Smac含量。

1.2.3 不同濃度H2O2干預高Ca2+刺激下Cyt-c的釋放 IPC模型實驗：將游離線粒體分為7組，（1）對照組（C組），2 μL線粒體重懸液至200 μL 25 min。（2）IR組，在C組的基礎上加2 μL Ca2+（Ca2+終濃度100 μmol/L）10 min。3組、4組、5組、6組和7組分別加入2 μL H2O2至200 μL體系 25 min，終濃度分別為1、2、5、20和100 μmol/L，在H2O2處理后再用2 μL Ca2+（Ca2+終濃度100 μmol/L）處理10 min。Cyt-c檢測方法同1.2.2。

1.2.4 小劑量H2O2對高Ca2+刺激下心磷脂活性的檢測 將游離線粒體分為5組：（1）Alone空白對照組。（2）NAO同型對照組。（3）NAO Ca2+100 μmol/L 組。（4）NAO 1 μmol/L H2O2組。（5）NAO 2 μmol/L H2O2組。用流式細胞術[5]經NAO染色后檢測心磷脂活性的變化，各組在1 μmol/L NAO 37℃孵育30 min，NAO僅使非氧化的心磷脂染色，NAO熒光降低表明心磷脂的氧化。用帶有FACScan程序的流式細胞儀在FL1-H通道檢測熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。多組比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度組Ca2+刺激游離線粒體Cyt-c、Smac釋放量比較 與C組比較，25、50和100 μmol/L組Cyt-c、Smac的釋放量顯著增高（P ＜0.05）。12.5 μmol/L組與C組比較，Cyt-c的釋放量顯著增高（P＜0.05），Smac的釋放量差異無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05）。25 μmol/L組與12.5 μmol/L組比較，Smac的釋放量顯著增高（P＜0.05），Cyt-c的釋放量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

Table 1 Comparison of free mitochondrial Cyt-c and Smac emissions between five groups表1 各組游離線粒體Cyt-c、Smac釋放量比較（n=6，%，ˉ±s）

Table 1 Comparison of free mitochondrial Cyt-c and Smac emissions between five groups表1 各組游離線粒體Cyt-c、Smac釋放量比較（n=6，%，ˉ±s）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與12.5 μmol/L組比較，c與25 μmol/L組比較，d與50 μmol/L組比較，P＜0.01

組別C組（1）12.5μmol/L組（2）25μmol/L組（3）50μmol/L組（4）100μmol/L組（5）F Cyt-c 0.050 3±0.001 7 0.119 7±0.009 2a0.131 8±0.012 1a0.417 9±0.011 6abc0.498 8±0.008 7abcd2 710.522＊＊Smac 0.130 1±0.023 1 0.128 9±0.002 9 0.196 0±0.002 3ab0.429 5±0.019 7abc0.682 7±0.028 3abcd998.722＊＊

2.2 H2O2及高Ca2+刺激后各組Cyt-c釋放量比較 IR組與C組比較，Cyt-c的釋放量顯著增高（P＜0.01）。與 IR 組比較，1 μmol/L H2O2組、2 μmol/L H2O2組Cyt-c的釋放量明顯減少，100 μmol/L H2O2組Cyt-c的釋放量顯著增高（P ＜ 0.05），與5、20 μmol/L H2O2組比較Cyt-c的釋放量差異無統(tǒng)計學意義。2 μmol/L H2O2組的Cyt-c釋放量高于1 μmol/L組（P＜0.05），20 μmol/L與100 μmol/L H2O2組的Cyt-c釋放量差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

Table 2 Comparison of free mitochondrial Cyt-c emissions between different IPC model groups表2 IPC模型組游離線粒體Cyt-c釋放量比較（n=6，%，ˉ±s）

Table 2 Comparison of free mitochondrial Cyt-c emissions between different IPC model groups表2 IPC模型組游離線粒體Cyt-c釋放量比較（n=6，%，ˉ±s）

＊＊P＜0.01

P組別C組（1）IR組（2）1 μmol/L H2O2組（3）2 μmol/L H2O2組（4）5 μmol/L H2O2組（5）20 μmol/L H2O2組（6）100 μmol/L H2O2組（7）F Cyt-c 0.139 1±0.102 6 0.664 4±0.095 7 0.280 0±0.182 6 0.471 3±0.066 1 0.575 7±0.081 7 0.765 2±0.113 0 0.793 0±0.095 6 29.572＊＊統(tǒng)計學處理組比（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）（2）∶（4）（2）∶（5）（2）∶（6）（2）∶（7）（3）∶（4）（6）∶（7）＜0.001 0.137 0.001 0.004 0.119 0.133 0.044 0.039 0.656

2.3 H2O2預處理對心磷脂與Cyt-c親和力的影響 NAO Ca2+100 μmol/L組的熒光強度低，心磷脂被氧化，氧化的心磷脂與Cty-c親和力下降，其他各組熒光強度明顯高于NAO Ca2+100 μmol/L組，證實小劑量H2O2可以逆轉高Ca2+引起的心磷脂活性的改變，心磷脂與Cty-c親和力增加，見圖1。

Figure 1 Activity changes of mitochondrial IPC model cardiolipin圖1 線粒體IPC模型心磷脂的活性變化

3 討論

3.1 Cyt-c、Smac的釋放量對Ca2+濃度具有依賴性 線粒體Cyt-c釋放是導致細胞凋亡的關鍵因素。正常情況下，Cyt-c存在于線粒體內外膜之間的膜間隙中，與線粒體內膜的心磷脂結合，不能漏出外膜；在嚴重缺血缺氧情況下，線粒體外膜破裂，Cyt-c從線粒體釋放入胞漿，導致細胞凋亡。Smac是一種存在于線粒體內外膜之間能調節(jié)細胞凋亡的蛋白，Smac從線粒體釋放入胞漿，與胞漿中凋亡抑制蛋白（IAPs）接觸，拮抗IAPs對半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）的抑制作用；Smac又可以促進前caspase-3水解，增強caspase-3的活性，促進細胞凋亡[6]。在鈣超載尤其伴有過氧化刺激時，線粒體mPTP打開，導致線粒體基質增加，外膜破裂，從而使得Cyt-c、Smac等釋放入胞漿中，導致細胞凋亡，這是被廣泛接受的缺血再灌注損傷的主要機制。本研究用外源的Ca2+刺激線粒體來模擬mPTP開放過程，結果顯示不同濃度Ca2+引起Cyt-c、Smac的釋放量不同，隨著Ca2+濃度增大，Cyt-c、Smac釋放量增加，而且具有濃度依賴性。Ca2+濃度為12.5 μmol/L時，mPTP已經開放，Ca2+濃度小于12.5 μmol/L時，Cyt-c、Smac幾乎不釋放，對線粒體基本無重要傷害，而100 μmol/L Ca2+對線粒體的傷害已經不可逆轉，表明100 μmol/L Ca2+模擬再灌注是可靠的。

3.2 小劑量H2O2可減少高Ca2+誘導的Cyt-c的釋放量 眾所周知，缺血再灌注損傷伴隨著線粒體內鈣超載和過氧化的刺激，導致線粒體功能紊亂和細胞凋亡。Cyt-c釋放是導致細胞凋亡的關鍵因素，Cyt-c的釋放機制及其在缺血再灌注損傷中的作用是近年來研究的熱點。而線粒體水平缺血預適應后，再灌注時Cyt-c的釋放情況尚不清楚。本研究用外源H2O2預處理游離線粒體，再用高Ca2+（100 μmol/L）模擬再灌注，結果顯示當H2O2濃度為1、2 μmol/L時可明顯減少高Ca2+刺激的Cyt-c釋放，而100 μmol/L的H2O2可使Cyt-c的釋放量顯著增高，表明低濃度H2O2預處理可減少高Ca2+誘導的Cyt-c釋放，減輕線粒體傷害和再灌注損傷，而高濃度H2O2則協(xié)同高Ca2+加重線粒體傷害。

3.3 線粒體水平IPC的保護機制 心磷脂是位于線粒體內膜上帶負電荷的磷脂，影響電子傳遞鏈中各種酶的活性；具有氧化特性的心磷脂通過調節(jié)caspase-8的活性，影響Cyt-c的釋放，所以與細胞凋亡機制有關。研究表明，降低心磷脂的含量或氧化心磷脂的不飽和脂肪酸都會影響Cyt-c與線粒體的結合，而應用抗氧化劑處理具有還原作用的蛋白，能減少Cyt-c的釋放，活性氧自由基（ROS）可以影響心磷脂氧化狀態(tài)，氧化的心磷脂與Cyt-c親和力下降，而非氧化心磷脂與Cyt-c親和力增強，可抑制Cyt-c釋放[7]。本次實驗假設外源低濃度H2O2（ROS的一種）對高Ca2+引起的Cyt-c的釋放有抑制作用，其機制可能是Cyt-c與線粒體內膜上的心磷脂結合得更緊密，從而阻滯了Cyt-c釋放。為證實這一假設，筆者應用NAO染料檢測心磷脂的活性。結果顯示高Ca2+組NAO熒光強度低，表明心磷脂氧化，與Cyt-c親和力下降，小劑量H2O2組熒光強度增強，表明氧化的心磷脂被逆轉，與Cyt-c親和力增強，可抑制Cyt-c釋放。因此，外源低濃度H2O2確實可以逆轉高Ca2+引起的心磷脂活性的改變。

綜上所述，在線粒體水平，IPC對缺血再灌注損傷的作用機制在于：低濃度H2O2預處理線粒體后，使Cyt-c與心磷脂的結合力增加，而使線粒體在高Ca2+（100 μmol/L Ca2+）刺激后Cyt-c釋放量減少，阻滯了凋亡途徑的發(fā)生；而高濃度H2O2則協(xié)同高Ca2+加重線粒體傷害，故可以用“毒物興奮效應”來解釋IPC的機制，為其研究提供出新的思路。對于H2O2作用于整個細胞，本研究顯示，低濃度H2O2能夠明顯減輕大鼠心肌細胞系（H9C2）缺氧復氧損傷，這一結果也能在大鼠原代心肌細胞（ARVM）上得到重復[8]，從而為心肌缺血再灌注損傷的預防提供理論依據(jù)和潛在的新藥靶點。對于其他細胞如腦、腎臟等，還需要以后進行深入的研究。

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（2013-05-22收稿 2013-11-01修回）

（本文編輯 李鵬）

Effect of Hydrogen Peroxide on Free Mitochondrial Cytochrome-c Release

LI Xiaoqian1,FENG Runhe2,LI Jing1,TANG Xiangdong1
1 Nankai University School of Medicine,Tianjin 300071,China;2 Tianjin Medical College

ObjectiveTo investigate the effect of hydrogen peroxide(H2O2)pretreatment on free mitochondrial cytochrome c(Cyt-c)release in mitochondrial levels,and reveal the mechanism of the ischemic preconditioning(IPC)on the ischemia reperfusion(IR)injury thereof.MethodsThe rat liver mitochondria was isolated and made free mitochondria.Free mitochondria were divided into 5 groups:control group(C)and different concentrations of Ca2+groups(12.5,25,50 and 100μmol/L).The levels of Cyt-c and second mitochondria-defived activator of caspase(Smac)were detected after 10 min stimulation of free mitochondria.The free mitochondrial IPC reperfusion model was made and divided into seven groups:C group,IR group and different concentrations of H2O2groups(2μL H2O2in 200μL system respectively,final concentration of 1,2,5,20 and 100μmol/L respectively).100μmol/L Ca2+was used again on the simulation of IR group.The level of Cyt-c release was detected.The changes in the activity of cardiolipin were detected in IR group and H2O2(1 and 2μmol/L of final concentration)groups.ResultsCompared with C group,there were significantly higher levels of Cyt-c and Smac emission in 25,50,and 100μmol/L Ca2+groups(P＜0.05).Compared with IR group,there was significantly decreased level of Cyt-c emission in H2O2(1 and 2μmol/L)groups(P＜0.05).The activity of cardiolipin was changed when reducing release of Cyt-c.ConclusionCyt-c was bonded with cardiolipin more closely when the low concentration of H2O2pretreatment in mitochondria.There was a lower level of Cyt-c emission in mitochondria after stimulation with high concentration of Ca2+(100μmol/L Ca2+).The blocking apoptotic pathway plays a key fact in the effect of IPC on IR injury.

hydrogen peroxide；cytochromes c；reperfusion injury；calcium overload；mitochondrial permeability transition pore

R363，R966 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.009

*國家自然科學基金資助項目（項目編號：81072629）；天津市自然科學基金資助項目（項目編號：10JCYBJC14800）；天津市高等學校科技發(fā)展基金項目（項目編號：20100115）

1南開大學醫(yī)學院（郵編300071）；2天津醫(yī)學高等?？茖W校

△通訊作者 E-mail:fengrunhe@163.com