呂俊琴+劉中兵+陳玲+

摘要:以鵝掌楸（Liriodendron chinensis Sarg.）嫩葉葉柄為外植體，優(yōu)化了愈傷組織誘導(dǎo)條件。結(jié)果表明，葉柄經(jīng)1 g/L的HgCl2溶液處理9 min，接種至添加2 g/L 50%多菌靈的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d時(shí)，成活率最高，達(dá)58.8%；愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是1/2 MS+0.2 mg/L 2，4-D + 2.0 mg/L 6-BA +0.15 mg/L NAA，誘導(dǎo)率達(dá)74.37%。

關(guān)鍵詞：鵝掌楸（Liriodendron chinensis Sarg.）；葉柄；正交試驗(yàn)；滅菌；愈傷組織誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)：S792.21文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０14）08－1933-03

Optimizing Callus Induction of Liriodendron chinensis Sarg. Petiole

L?譈 Jun-qina，LIU Zhong-bingb，CHEN Lingb

（a.Department of Biological Science and Technology;b. Department of Landscape Architecture， Wuhan Bioengineering Institute， Wuhan 430415， China）

Abstract: To explore the best method of explants disinfection and optimal condition of callus induction， Callus were induced from explants of Liriodendron chinensis petiole. The results showed that when the petiole was treated by 0.1% HgCl2 for 9 min and cultivated in MS medium with 2 g/L 50% carbendazim， Wp has the lowest contamination rate of 41.2%. The optimal formula of callus induction was 1/2 MS+0.2 mg/L 2，4-D + 2.0 mg/L 6-BA +0.15 mg/L NAA with the rate of callus induction of 74.37%.

Key words: Liriodendron chinensis Sarg.；petiole；orthogonal test；sterilization； callus induction

鵝掌楸（Liriodendron chinensis Sarg.）為木蘭科鵝掌楸屬落葉喬木［1］，其植物樹干端直葉形奇特，花大而美麗，成為珍貴的觀賞植物，在園林中多作為行道樹和景觀樹。同時(shí)，鵝掌楸材質(zhì)細(xì)致、不易干裂變形、紋理漂亮，可作為優(yōu)質(zhì)木材樹種［2］。此外，鵝掌楸的樹皮可入藥、祛風(fēng)濕，具有較高的藥用價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其深度開發(fā)利用前景廣闊［3］。為保護(hù)和利用該珍稀樹種，需要建立鵝掌楸組織培養(yǎng)繁殖體系，高效繁殖鵝掌楸對(duì)擴(kuò)大種群優(yōu)勢(shì)以及開發(fā)利用具有重要意義，蔣澤平等［4］、田敏等［5］、陳穎等［6］利用鵝掌楸冬芽、葉片、種子為外植體，均獲得了愈傷組織、再生器官或植株，但利用葉柄進(jìn)行離體再生，誘導(dǎo)愈傷組織的試驗(yàn)未見報(bào)道。本研究以鵝掌楸葉柄為外植體，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化了鵝掌楸愈傷組織誘導(dǎo)條件，為其高效快繁、遺傳改良提供了參考。

1材料與方法

1.1材料

鵝掌楸枝條上萌發(fā)的幼葉葉柄采自武漢生物工程學(xué)院校園，為10年生、無病毒、生長(zhǎng)健壯的鵝掌楸。

1.2方法

1.2.1外植體的消毒將外植體置于流水下沖洗干凈，采用75%乙醇消毒5 s，無菌水沖洗3次后置于1 g/L的HgCl2溶液中消毒7~10 min，晃動(dòng)容器使葉柄充分與溶液接觸，再用無菌水沖洗5次，然后將葉柄剪成大小為0.5~1.0 cm組織塊，分別接種到MS基本培養(yǎng)基和含2 g/L 50%多菌靈的MS基本培養(yǎng)基［7］，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。培養(yǎng)室溫度（25±2）℃，光照時(shí)間12 h/d，光照度2 000~3 000 lx。在培養(yǎng)10、20 d后觀察外植體污染、死亡以及成活情況，并統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率及成活率。

1.2.2愈傷組織的誘導(dǎo)為了優(yōu)化鵝掌楸葉柄愈傷組織誘導(dǎo)條件，采用L9（34）正交試驗(yàn)，其因素與水平見表2。培養(yǎng)基中蔗糖為3.0%，瓊脂為0.7%，pH 5.8，為防止褐化，添加了80 mg/L的檸檬酸。每組處理接種一定量的無菌材料，重復(fù)3次。從第七天后開始觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況，45 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒處理對(duì)外植體的影響

不同消毒處理的外植體在培養(yǎng)初期，污染率、死亡率總體趨勢(shì)是隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率降低，而死亡率增加（表3）。培養(yǎng)10 d時(shí)，污染率最低、死亡率最高均為處理8，分別為5.9％、33.3%。成活率最高的為處理3，成活率為74.8%；培養(yǎng)20 d時(shí)，污染率較10 d時(shí)大幅增長(zhǎng)，死亡率略有增長(zhǎng)或相近，其中處理8的污染率最低、死亡率最高，分別為19.6%、35.2%。成活率最高的為處理7，為58.8%。

消毒時(shí)間對(duì)于滅菌效果有較大的影響，為了獲得較低的污染率，可適當(dāng)延長(zhǎng)消毒時(shí)間。鵝掌楸作為木本植物，雜菌污染嚴(yán)重，其內(nèi)生菌較活躍，培養(yǎng)20 d時(shí)污染增加，內(nèi)生菌污染所導(dǎo)致。在試驗(yàn)過程中，外植體污染的癥狀大多為出現(xiàn)霉點(diǎn)或菌絲，這是典型的內(nèi)生菌污染現(xiàn)象。處理5~處理8的培養(yǎng)基中均添加了內(nèi)吸性滅菌劑多菌靈，相同消毒時(shí)間，外植體污染率在接種10、20 d時(shí)較處理1~處理4的低，表明多菌靈對(duì)內(nèi)生菌污染有明顯的抑制作用。結(jié)合外植體的成活率考慮，處理7為消毒最佳方案，即葉柄用1 g/L的HgCl2溶液消毒9 min ，接種至添加2 g/L 50%多菌靈的MS培養(yǎng)基中可以獲得較好的效果。

2.2不同處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將無菌材料接入處理9~處理17的培養(yǎng)基中，觀察發(fā)現(xiàn)，部分葉柄接種7 d后，一端或兩端膨大，或整個(gè)均勻變粗（圖1），14 d后，部分葉柄切口處能形成綠色致密顆粒狀愈傷組織（圖2），隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，愈傷組織不斷增殖（圖3）。培養(yǎng)45 d后，所有處理組合中均誘導(dǎo)出愈傷組織，且大部分誘導(dǎo)的愈傷組織首先出現(xiàn)在切口處，然后不斷地增殖。

正交試驗(yàn)結(jié)果（表4）表明，影響外植體愈傷組織誘導(dǎo)率因素的主次順序是基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA、2，4-D，最佳組合為A1B1C3D3，由于B因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率影響最小，B因素取3水平時(shí)，愈傷組織平均誘導(dǎo)率最高，則本試驗(yàn)中愈傷組織誘導(dǎo)率最佳組合是A1B3C3D3，即1/2 MS+0.2 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA，誘導(dǎo)率達(dá)74.37%。

3討論

1）為了克服鵝掌楸內(nèi)生菌污染問題，本研究使用1 g/L的HgCl2溶液進(jìn)行表面消毒外，還在培養(yǎng)基中添加2 g/L 50%多菌靈可濕性粉劑措施來進(jìn)行消毒，取得一定的效果，培養(yǎng)20 d污染趨于穩(wěn)定，成活率為58.8%。對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)來說，外植體成活率還是比較低，會(huì)增加生產(chǎn)成本。因此，木本植物材料的消毒問題有待進(jìn)一步探討。

2）培養(yǎng)物的褐變往往會(huì)影響培養(yǎng)的效果。鵝掌楸屬多年生木本植物，在培養(yǎng)的過程中材料極易褐化［8］，本研究中雖然在培養(yǎng)基中加入了檸檬酸，外植體和愈傷組織在培養(yǎng)過程中仍觀察到褐變現(xiàn)象。對(duì)于鵝掌楸組織培養(yǎng)過程中的褐變問題，還需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 卓麗環(huán)，陳龍清.園林樹木學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.

［2］ 曹娓，姜衛(wèi)兵，翁忙玲. 鵝掌楸及其在園林綠化中的應(yīng)用［J］，中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（8）：319-321.

［3］ 張富云，趙燕.鵝掌楸屬植物研究進(jìn)展［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，20（5）：1045-1046.

［4］ 蔣澤平，梁珍海，李勁，等.雜交鵝掌楸的離體培養(yǎng)和植株再生研究［J］.江蘇林業(yè)科技，2004，31（6）:5-7.

［5］ 田敏，李紀(jì)元，范正琪，等.雜交鵝掌楸離體培養(yǎng)中器官發(fā)生的研究［J］.林業(yè)科學(xué)研究2005，18（5）: 546-550.

［6］ 陳穎，周統(tǒng)建，曹福亮，等.北美鵝掌楸組培快繁技術(shù)體系的建立［J］.浙江林業(yè)科技，2007，29（6）:29-31.

［7］ 徐忠傳，何俊榮，周靜亞，等.多菌靈在黃精根莖無菌培養(yǎng)中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2006（增刊）：400-402.

［8］翟曉巧.木本植物組織培養(yǎng)褐化控制策略［J］. 河南林業(yè)科技，2008，28（1）:38-40.

（責(zé)任編輯 屠晶）

摘要:以鵝掌楸（Liriodendron chinensis Sarg.）嫩葉葉柄為外植體，優(yōu)化了愈傷組織誘導(dǎo)條件。結(jié)果表明，葉柄經(jīng)1 g/L的HgCl2溶液處理9 min，接種至添加2 g/L 50%多菌靈的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d時(shí)，成活率最高，達(dá)58.8%；愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是1/2 MS+0.2 mg/L 2，4-D + 2.0 mg/L 6-BA +0.15 mg/L NAA，誘導(dǎo)率達(dá)74.37%。

關(guān)鍵詞：鵝掌楸（Liriodendron chinensis Sarg.）；葉柄；正交試驗(yàn)；滅菌；愈傷組織誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)：S792.21文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０14）08－1933-03

Optimizing Callus Induction of Liriodendron chinensis Sarg. Petiole

L?譈 Jun-qina，LIU Zhong-bingb，CHEN Lingb

（a.Department of Biological Science and Technology;b. Department of Landscape Architecture， Wuhan Bioengineering Institute， Wuhan 430415， China）

Abstract: To explore the best method of explants disinfection and optimal condition of callus induction， Callus were induced from explants of Liriodendron chinensis petiole. The results showed that when the petiole was treated by 0.1% HgCl2 for 9 min and cultivated in MS medium with 2 g/L 50% carbendazim， Wp has the lowest contamination rate of 41.2%. The optimal formula of callus induction was 1/2 MS+0.2 mg/L 2，4-D + 2.0 mg/L 6-BA +0.15 mg/L NAA with the rate of callus induction of 74.37%.

Key words: Liriodendron chinensis Sarg.；petiole；orthogonal test；sterilization； callus induction

鵝掌楸（Liriodendron chinensis Sarg.）為木蘭科鵝掌楸屬落葉喬木［1］，其植物樹干端直葉形奇特，花大而美麗，成為珍貴的觀賞植物，在園林中多作為行道樹和景觀樹。同時(shí)，鵝掌楸材質(zhì)細(xì)致、不易干裂變形、紋理漂亮，可作為優(yōu)質(zhì)木材樹種［2］。此外，鵝掌楸的樹皮可入藥、祛風(fēng)濕，具有較高的藥用價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其深度開發(fā)利用前景廣闊［3］。為保護(hù)和利用該珍稀樹種，需要建立鵝掌楸組織培養(yǎng)繁殖體系，高效繁殖鵝掌楸對(duì)擴(kuò)大種群優(yōu)勢(shì)以及開發(fā)利用具有重要意義，蔣澤平等［4］、田敏等［5］、陳穎等［6］利用鵝掌楸冬芽、葉片、種子為外植體，均獲得了愈傷組織、再生器官或植株，但利用葉柄進(jìn)行離體再生，誘導(dǎo)愈傷組織的試驗(yàn)未見報(bào)道。本研究以鵝掌楸葉柄為外植體，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化了鵝掌楸愈傷組織誘導(dǎo)條件，為其高效快繁、遺傳改良提供了參考。

1材料與方法

1.1材料

鵝掌楸枝條上萌發(fā)的幼葉葉柄采自武漢生物工程學(xué)院校園，為10年生、無病毒、生長(zhǎng)健壯的鵝掌楸。

1.2方法

1.2.1外植體的消毒將外植體置于流水下沖洗干凈，采用75%乙醇消毒5 s，無菌水沖洗3次后置于1 g/L的HgCl2溶液中消毒7~10 min，晃動(dòng)容器使葉柄充分與溶液接觸，再用無菌水沖洗5次，然后將葉柄剪成大小為0.5~1.0 cm組織塊，分別接種到MS基本培養(yǎng)基和含2 g/L 50%多菌靈的MS基本培養(yǎng)基［7］，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。培養(yǎng)室溫度（25±2）℃，光照時(shí)間12 h/d，光照度2 000~3 000 lx。在培養(yǎng)10、20 d后觀察外植體污染、死亡以及成活情況，并統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率及成活率。

1.2.2愈傷組織的誘導(dǎo)為了優(yōu)化鵝掌楸葉柄愈傷組織誘導(dǎo)條件，采用L9（34）正交試驗(yàn)，其因素與水平見表2。培養(yǎng)基中蔗糖為3.0%，瓊脂為0.7%，pH 5.8，為防止褐化，添加了80 mg/L的檸檬酸。每組處理接種一定量的無菌材料，重復(fù)3次。從第七天后開始觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況，45 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒處理對(duì)外植體的影響

不同消毒處理的外植體在培養(yǎng)初期，污染率、死亡率總體趨勢(shì)是隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率降低，而死亡率增加（表3）。培養(yǎng)10 d時(shí)，污染率最低、死亡率最高均為處理8，分別為5.9％、33.3%。成活率最高的為處理3，成活率為74.8%；培養(yǎng)20 d時(shí)，污染率較10 d時(shí)大幅增長(zhǎng)，死亡率略有增長(zhǎng)或相近，其中處理8的污染率最低、死亡率最高，分別為19.6%、35.2%。成活率最高的為處理7，為58.8%。

消毒時(shí)間對(duì)于滅菌效果有較大的影響，為了獲得較低的污染率，可適當(dāng)延長(zhǎng)消毒時(shí)間。鵝掌楸作為木本植物，雜菌污染嚴(yán)重，其內(nèi)生菌較活躍，培養(yǎng)20 d時(shí)污染增加，內(nèi)生菌污染所導(dǎo)致。在試驗(yàn)過程中，外植體污染的癥狀大多為出現(xiàn)霉點(diǎn)或菌絲，這是典型的內(nèi)生菌污染現(xiàn)象。處理5~處理8的培養(yǎng)基中均添加了內(nèi)吸性滅菌劑多菌靈，相同消毒時(shí)間，外植體污染率在接種10、20 d時(shí)較處理1~處理4的低，表明多菌靈對(duì)內(nèi)生菌污染有明顯的抑制作用。結(jié)合外植體的成活率考慮，處理7為消毒最佳方案，即葉柄用1 g/L的HgCl2溶液消毒9 min ，接種至添加2 g/L 50%多菌靈的MS培養(yǎng)基中可以獲得較好的效果。

2.2不同處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將無菌材料接入處理9~處理17的培養(yǎng)基中，觀察發(fā)現(xiàn)，部分葉柄接種7 d后，一端或兩端膨大，或整個(gè)均勻變粗（圖1），14 d后，部分葉柄切口處能形成綠色致密顆粒狀愈傷組織（圖2），隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，愈傷組織不斷增殖（圖3）。培養(yǎng)45 d后，所有處理組合中均誘導(dǎo)出愈傷組織，且大部分誘導(dǎo)的愈傷組織首先出現(xiàn)在切口處，然后不斷地增殖。

正交試驗(yàn)結(jié)果（表4）表明，影響外植體愈傷組織誘導(dǎo)率因素的主次順序是基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA、2，4-D，最佳組合為A1B1C3D3，由于B因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率影響最小，B因素取3水平時(shí)，愈傷組織平均誘導(dǎo)率最高，則本試驗(yàn)中愈傷組織誘導(dǎo)率最佳組合是A1B3C3D3，即1/2 MS+0.2 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA，誘導(dǎo)率達(dá)74.37%。

3討論

1）為了克服鵝掌楸內(nèi)生菌污染問題，本研究使用1 g/L的HgCl2溶液進(jìn)行表面消毒外，還在培養(yǎng)基中添加2 g/L 50%多菌靈可濕性粉劑措施來進(jìn)行消毒，取得一定的效果，培養(yǎng)20 d污染趨于穩(wěn)定，成活率為58.8%。對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)來說，外植體成活率還是比較低，會(huì)增加生產(chǎn)成本。因此，木本植物材料的消毒問題有待進(jìn)一步探討。

2）培養(yǎng)物的褐變往往會(huì)影響培養(yǎng)的效果。鵝掌楸屬多年生木本植物，在培養(yǎng)的過程中材料極易褐化［8］，本研究中雖然在培養(yǎng)基中加入了檸檬酸，外植體和愈傷組織在培養(yǎng)過程中仍觀察到褐變現(xiàn)象。對(duì)于鵝掌楸組織培養(yǎng)過程中的褐變問題，還需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 卓麗環(huán)，陳龍清.園林樹木學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.

［2］ 曹娓，姜衛(wèi)兵，翁忙玲. 鵝掌楸及其在園林綠化中的應(yīng)用［J］，中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（8）：319-321.

［3］ 張富云，趙燕.鵝掌楸屬植物研究進(jìn)展［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，20（5）：1045-1046.

［4］ 蔣澤平，梁珍海，李勁，等.雜交鵝掌楸的離體培養(yǎng)和植株再生研究［J］.江蘇林業(yè)科技，2004，31（6）:5-7.

［5］ 田敏，李紀(jì)元，范正琪，等.雜交鵝掌楸離體培養(yǎng)中器官發(fā)生的研究［J］.林業(yè)科學(xué)研究2005，18（5）: 546-550.

［6］ 陳穎，周統(tǒng)建，曹福亮，等.北美鵝掌楸組培快繁技術(shù)體系的建立［J］.浙江林業(yè)科技，2007，29（6）:29-31.

［7］ 徐忠傳，何俊榮，周靜亞，等.多菌靈在黃精根莖無菌培養(yǎng)中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2006（增刊）：400-402.

［8］翟曉巧.木本植物組織培養(yǎng)褐化控制策略［J］. 河南林業(yè)科技，2008，28（1）:38-40.

（責(zé)任編輯 屠晶）

摘要:以鵝掌楸（Liriodendron chinensis Sarg.）嫩葉葉柄為外植體，優(yōu)化了愈傷組織誘導(dǎo)條件。結(jié)果表明，葉柄經(jīng)1 g/L的HgCl2溶液處理9 min，接種至添加2 g/L 50%多菌靈的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d時(shí)，成活率最高，達(dá)58.8%；愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是1/2 MS+0.2 mg/L 2，4-D + 2.0 mg/L 6-BA +0.15 mg/L NAA，誘導(dǎo)率達(dá)74.37%。

關(guān)鍵詞：鵝掌楸（Liriodendron chinensis Sarg.）；葉柄；正交試驗(yàn)；滅菌；愈傷組織誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)：S792.21文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０14）08－1933-03

Optimizing Callus Induction of Liriodendron chinensis Sarg. Petiole

L?譈 Jun-qina，LIU Zhong-bingb，CHEN Lingb

（a.Department of Biological Science and Technology;b. Department of Landscape Architecture， Wuhan Bioengineering Institute， Wuhan 430415， China）

Abstract: To explore the best method of explants disinfection and optimal condition of callus induction， Callus were induced from explants of Liriodendron chinensis petiole. The results showed that when the petiole was treated by 0.1% HgCl2 for 9 min and cultivated in MS medium with 2 g/L 50% carbendazim， Wp has the lowest contamination rate of 41.2%. The optimal formula of callus induction was 1/2 MS+0.2 mg/L 2，4-D + 2.0 mg/L 6-BA +0.15 mg/L NAA with the rate of callus induction of 74.37%.

Key words: Liriodendron chinensis Sarg.；petiole；orthogonal test；sterilization； callus induction

鵝掌楸（Liriodendron chinensis Sarg.）為木蘭科鵝掌楸屬落葉喬木［1］，其植物樹干端直葉形奇特，花大而美麗，成為珍貴的觀賞植物，在園林中多作為行道樹和景觀樹。同時(shí)，鵝掌楸材質(zhì)細(xì)致、不易干裂變形、紋理漂亮，可作為優(yōu)質(zhì)木材樹種［2］。此外，鵝掌楸的樹皮可入藥、祛風(fēng)濕，具有較高的藥用價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其深度開發(fā)利用前景廣闊［3］。為保護(hù)和利用該珍稀樹種，需要建立鵝掌楸組織培養(yǎng)繁殖體系，高效繁殖鵝掌楸對(duì)擴(kuò)大種群優(yōu)勢(shì)以及開發(fā)利用具有重要意義，蔣澤平等［4］、田敏等［5］、陳穎等［6］利用鵝掌楸冬芽、葉片、種子為外植體，均獲得了愈傷組織、再生器官或植株，但利用葉柄進(jìn)行離體再生，誘導(dǎo)愈傷組織的試驗(yàn)未見報(bào)道。本研究以鵝掌楸葉柄為外植體，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化了鵝掌楸愈傷組織誘導(dǎo)條件，為其高效快繁、遺傳改良提供了參考。

1材料與方法

1.1材料

鵝掌楸枝條上萌發(fā)的幼葉葉柄采自武漢生物工程學(xué)院校園，為10年生、無病毒、生長(zhǎng)健壯的鵝掌楸。

1.2方法

1.2.1外植體的消毒將外植體置于流水下沖洗干凈，采用75%乙醇消毒5 s，無菌水沖洗3次后置于1 g/L的HgCl2溶液中消毒7~10 min，晃動(dòng)容器使葉柄充分與溶液接觸，再用無菌水沖洗5次，然后將葉柄剪成大小為0.5~1.0 cm組織塊，分別接種到MS基本培養(yǎng)基和含2 g/L 50%多菌靈的MS基本培養(yǎng)基［7］，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。培養(yǎng)室溫度（25±2）℃，光照時(shí)間12 h/d，光照度2 000~3 000 lx。在培養(yǎng)10、20 d后觀察外植體污染、死亡以及成活情況，并統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率及成活率。

1.2.2愈傷組織的誘導(dǎo)為了優(yōu)化鵝掌楸葉柄愈傷組織誘導(dǎo)條件，采用L9（34）正交試驗(yàn)，其因素與水平見表2。培養(yǎng)基中蔗糖為3.0%，瓊脂為0.7%，pH 5.8，為防止褐化，添加了80 mg/L的檸檬酸。每組處理接種一定量的無菌材料，重復(fù)3次。從第七天后開始觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況，45 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒處理對(duì)外植體的影響

不同消毒處理的外植體在培養(yǎng)初期，污染率、死亡率總體趨勢(shì)是隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率降低，而死亡率增加（表3）。培養(yǎng)10 d時(shí)，污染率最低、死亡率最高均為處理8，分別為5.9％、33.3%。成活率最高的為處理3，成活率為74.8%；培養(yǎng)20 d時(shí)，污染率較10 d時(shí)大幅增長(zhǎng)，死亡率略有增長(zhǎng)或相近，其中處理8的污染率最低、死亡率最高，分別為19.6%、35.2%。成活率最高的為處理7，為58.8%。

消毒時(shí)間對(duì)于滅菌效果有較大的影響，為了獲得較低的污染率，可適當(dāng)延長(zhǎng)消毒時(shí)間。鵝掌楸作為木本植物，雜菌污染嚴(yán)重，其內(nèi)生菌較活躍，培養(yǎng)20 d時(shí)污染增加，內(nèi)生菌污染所導(dǎo)致。在試驗(yàn)過程中，外植體污染的癥狀大多為出現(xiàn)霉點(diǎn)或菌絲，這是典型的內(nèi)生菌污染現(xiàn)象。處理5~處理8的培養(yǎng)基中均添加了內(nèi)吸性滅菌劑多菌靈，相同消毒時(shí)間，外植體污染率在接種10、20 d時(shí)較處理1~處理4的低，表明多菌靈對(duì)內(nèi)生菌污染有明顯的抑制作用。結(jié)合外植體的成活率考慮，處理7為消毒最佳方案，即葉柄用1 g/L的HgCl2溶液消毒9 min ，接種至添加2 g/L 50%多菌靈的MS培養(yǎng)基中可以獲得較好的效果。

2.2不同處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將無菌材料接入處理9~處理17的培養(yǎng)基中，觀察發(fā)現(xiàn)，部分葉柄接種7 d后，一端或兩端膨大，或整個(gè)均勻變粗（圖1），14 d后，部分葉柄切口處能形成綠色致密顆粒狀愈傷組織（圖2），隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，愈傷組織不斷增殖（圖3）。培養(yǎng)45 d后，所有處理組合中均誘導(dǎo)出愈傷組織，且大部分誘導(dǎo)的愈傷組織首先出現(xiàn)在切口處，然后不斷地增殖。

正交試驗(yàn)結(jié)果（表4）表明，影響外植體愈傷組織誘導(dǎo)率因素的主次順序是基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA、2，4-D，最佳組合為A1B1C3D3，由于B因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率影響最小，B因素取3水平時(shí)，愈傷組織平均誘導(dǎo)率最高，則本試驗(yàn)中愈傷組織誘導(dǎo)率最佳組合是A1B3C3D3，即1/2 MS+0.2 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA，誘導(dǎo)率達(dá)74.37%。

3討論

1）為了克服鵝掌楸內(nèi)生菌污染問題，本研究使用1 g/L的HgCl2溶液進(jìn)行表面消毒外，還在培養(yǎng)基中添加2 g/L 50%多菌靈可濕性粉劑措施來進(jìn)行消毒，取得一定的效果，培養(yǎng)20 d污染趨于穩(wěn)定，成活率為58.8%。對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)來說，外植體成活率還是比較低，會(huì)增加生產(chǎn)成本。因此，木本植物材料的消毒問題有待進(jìn)一步探討。

2）培養(yǎng)物的褐變往往會(huì)影響培養(yǎng)的效果。鵝掌楸屬多年生木本植物，在培養(yǎng)的過程中材料極易褐化［8］，本研究中雖然在培養(yǎng)基中加入了檸檬酸，外植體和愈傷組織在培養(yǎng)過程中仍觀察到褐變現(xiàn)象。對(duì)于鵝掌楸組織培養(yǎng)過程中的褐變問題，還需要進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 屠晶）