羅鳴+劉海+李娟+吳明開+

摘要：以流蘇石斛（Dendrobium fimbriatum Hook.）為試料，研究了種子萌發(fā)形成原球莖，原球莖的增殖培養(yǎng)、器官分化，建立了快速繁殖體系，經(jīng)過初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)，成功培育出再生植株，并對組培苗的大棚移栽馴化等方面進(jìn)行研究，初步形成從組培快繁到大棚生產(chǎn)的一系列培育過程，為流蘇石斛的規(guī)?；a(chǎn)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：流蘇石斛（Dendrobium fimbriatum Hook.）；無菌萌發(fā)；組織培養(yǎng)；煉苗馴化

中圖分類號：S603.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）08－1930-03

Tissue Culture and Traininｇ Ｐｌａｎｔｌｅｔ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ Ｈｏｏｋ．

ＬＵＯ Ｍｉｎｇ１，２，３，ＬＩＵ Ｈａｉ１，２，３，ＬＩ Ｊｕａｎ２，ＷＵ Ｍｉｎｇ－ｋａｉ２，３

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００１， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｍｏｄｅｒｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００６， Ｃｈｉｎａ；

３． Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ， rｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｂｕｌｂｓ， ｃｏｒｍｓ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｏｒｇａｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｒａｐｉｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ， ｉｎｉｔｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ． Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ. A ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｆｏｓｔｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ and ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ were ｉｎｉｔｉａｌｌｙ ｆｏｒｍｅｄ. It will ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ Ｈｏｏｋ．； ａｓｅｐｔｉｃ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ； ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｔｒａｉｎｉｎｇ ｐｌａｎｔｌｅｔ

流蘇石斛（Dendrobium fimbriatum Hook.）又名馬鞭石斛，為蘭科石斛屬附生植物，具有很高的藥用價值，是收載于《中國藥典》石斛的原植物之一［1］，其花非常艷麗，具有較高的觀賞價值?，F(xiàn)代藥理研究表明石斛具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖、提高免疫功能等作用。在治療惡性腫瘤、胃腸道疾病、糖尿病、白內(nèi)障、關(guān)節(jié)炎、血栓閉塞性脈管炎及慢性咽炎等疾病具有很好的療效［2-4］。近年來，隨著市場需求量不斷增加，野生資源被過度采挖，加上其自身繁殖特性以及對生長環(huán)境的特殊要求，流蘇石斛野生資源瀕臨枯竭［5］。人工培育是解決珍稀瀕危藥用植物資源保護(hù)與滿足市場需求矛盾的一種有效手段。流蘇石斛輔以人工授粉可以獲得大量種子，一個蒴果含有幾萬到十幾萬粒種子，但石斛種子自然萌發(fā)率極低，進(jìn)行種子無菌萌發(fā)能獲得大量組培苗［6-8］。目前種子無菌萌發(fā)技術(shù)較為成熟，但組培苗煉苗移栽技術(shù)不夠成熟，缺乏大量健壯優(yōu)質(zhì)種苗成為制約流蘇石斛進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)發(fā)展的技術(shù)瓶頸，本研究為獲得健壯優(yōu)質(zhì)種苗及幼苗的批量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

流蘇石斛收集于云南省文山壯族苗族自治州，保存于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭科植物活體保存圃中。

1.2培養(yǎng)基

初代培養(yǎng)基：1/2 MＳ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ，添加２５ ｇ／Ｌ蔗糖、６．５ ｇ／Ｌ瓊脂，ｐＨ ５．８。

繼代培養(yǎng)基：１／２ ＭＳ＋ ０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ，添加２５ ｇ／Ｌ蔗糖、６．５ ｇ／Ｌ瓊脂，２００ ｇ／Ｌ馬鈴薯泥，ｐＨ ５．８。

壯苗生根培養(yǎng)基：改良培養(yǎng)基（ＷＭ）［９］＋２．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，添加３０ ｇ／Ｌ蔗糖、６．５ ｇ／Ｌ瓊脂、１００ ｇ／Ｌ香蕉汁，ｐＨ ５．６。

1.3流蘇石斛無菌播種

流蘇石斛開花后進(jìn)行人工授粉結(jié)實(shí)，采集后將蒴果在流水下沖洗干凈，用吸水紙吸干水分，置于超凈工作臺上。用75%乙醇擦拭表皮2次，然后用0.1%的升汞浸泡10 min，用無菌水沖洗5次，用吸水紙吸干表面的水分，用滅菌后的醫(yī)用脫脂棉包裹后，放置于4 ℃下保存。取出保存的蒴果進(jìn)行播種，在無菌條件下，用解剖刀切開蒴果，將種子撒到培養(yǎng)基內(nèi)。溫度為（24±2） ℃，光照時間12 h/d，光照度2 000 lx，濕度30%~50%。

1.4流蘇石斛組培苗煉苗移栽

移栽前先將瓶苗放置大棚內(nèi)先煉苗5 d，讓瓶苗從封閉穩(wěn)定的環(huán)境向開放變化的環(huán)境過渡，慢慢適應(yīng)自然環(huán)境。以生長健壯、葉色正常，肉質(zhì)莖有3~4個節(jié)間、4~5片葉，4~5條根（長3 cm以上），根皮色白中帶綠、無黑色根、無畸形、無變異的苗為試驗(yàn)材料。

組培苗出瓶時，將培養(yǎng)基與組培苗一起輕輕取出，放置于盆中待清洗，污染苗、裸根苗或少根苗分別放置。特別要洗凈培養(yǎng)基，以免剩余培養(yǎng)基發(fā)霉引起爛根，再換自來水清洗1~2次。污染苗經(jīng)過清洗后，用1 000倍多菌靈浸泡整株小苗10 min，以控制污染。

將所有流蘇石斛組培苗按莖長分為大（>6 cm）、中（4~6 cm）、?。?lt;4 cm）3個等級（圖3），每個等級選取30株長勢相同的組培苗。將其栽種于樹皮（2~3 cm）和細(xì)鋸末的等量混合的培養(yǎng)基質(zhì)中，選取優(yōu)質(zhì)種苗后，進(jìn)行不同基質(zhì)處理的煉苗試驗(yàn)，統(tǒng)計莖粗平均生長量和莖粗增長率。

處理Ⅰ：長度2~3 cm的樹皮和細(xì)鋸末的等量混合；處理Ⅱ：長度2~3 cm的樹皮和直徑1 cm的陶土等量混合；處理Ⅲ：蘭花土和直徑1 cm的陶土等量混合。

2結(jié)果與分析

2.1流蘇石斛組培育苗結(jié)果

由圖1可以看出，種子在播種初代培養(yǎng)基10 d后開始萌發(fā)；20 d后可以觀察到流蘇石斛種子由黃綠色變?yōu)榫G色小圓球；40 d后綠色圓球發(fā)育出葉尖；60 d后綠色圓球進(jìn)一步發(fā)育；80 d左右經(jīng)過大部分發(fā)育生長出2片幼葉，同時原球莖大量增殖，這時為了保障組培苗的營養(yǎng)供應(yīng)與充分發(fā)育，應(yīng)及時進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，接種繼代培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)接后的流蘇石斛組培苗放置于溫度為（22±2）℃、光照時間12 h/d、光照度2 000 lx、濕度30%~50%的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，2~3個月后再進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，組培苗分蘗增殖，普遍形成叢苗，長勢良好；在利用改良培養(yǎng)基進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)，可以獲得大量出瓶煉苗馴化移栽，根系發(fā)達(dá)的壯苗。

2.2流蘇石斛組培苗煉苗移栽結(jié)果

煉苗處理100 d后對流蘇石斛組培幼苗進(jìn)行統(tǒng)計。小于4 cm的組培苗成活率為90.0%，4~6 cm的組培苗成活率為86.7%，大于6 cm的組培苗成活率最高為96.7%。然后以莖粗每隔25 d的平均生長量為依據(jù)，統(tǒng)計分析3種基質(zhì)中30株莖長大于6 cm的流蘇石斛幼苗的平均莖粗（表1）。煉苗馴化25 d時，處理Ⅲ平均莖粗增長率最大為63.70%；煉苗馴化50 d時，處理Ⅲ平均莖粗增長率最大為133.09%；但馴化75 d時，處理Ⅰ平均莖粗增長率最大為203.59%，高于處理Ⅱ、Ⅲ的平均莖粗增長率；并且在100 d時，處理Ⅰ平均莖粗增長率達(dá)到208.01%，生長優(yōu)勢更為明顯。

3小結(jié)與討論

流蘇石斛種子無菌萌發(fā)適宜培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA，添加25 g/L蔗糖，6.5 g/L瓊脂，pH 5.8，種子萌發(fā)快，萌發(fā)率高；繼代培養(yǎng)適宜培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，添加25 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，200 g/L馬鈴薯泥，pH 5.8，組培苗生長旺盛；壯苗生根適宜培養(yǎng)基為改良培養(yǎng)基（WM）［9］+2 mg/L NAA，添加30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂、100 g/L香蕉汁，pH 5.6，苗壯、根系發(fā)達(dá)。

流蘇石斛作為中藥材，既可以全株入藥，也可以新鮮莖入藥，因此莖粗、株高、新根數(shù)等都是衡量產(chǎn)量的重要指標(biāo)。根據(jù)各個基質(zhì)處理的莖粗信息，處理Ⅰ中的組培苗在生長過程中莖較粗，更能促進(jìn)流蘇石斛的生長發(fā)育，其特點(diǎn)是鋸末比例較高，基質(zhì)通透性和保水保肥性比較好，更適合鐵皮石斛生長［10］。處理Ⅱ保水保肥性能較差，不適合流蘇石斛的生長。處理Ⅲ由于使用蘭花土導(dǎo)致基質(zhì)通透性變差，也不太適合流蘇石斛的生長。

參考文獻(xiàn)：

［１］國家藥典委員會． 中華人民共和國藥典［Ｍ］．北京：中國醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)出版社，２０１０．

［２］高學(xué)敏．中藥學(xué)［Ｍ］．北京：中國中醫(yī)藥出版社， ２００２．５５３．

［３］ 王憲楷，趙同芳．石斛屬植物的化學(xué)成分與中藥石斛［Ｊ］．中國藥學(xué)雜志，１９８６，２１（１１）：６６６-669．

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［５］劉強(qiáng)，殷壽華，黃文，等．流蘇石斛瀕危原因及資源保護(hù)［Ｊ］．亞熱帶植物科學(xué)，２００７，３６（４）：４５－４７．

［６］ 黃勇．流蘇石斛組織培養(yǎng)體系研究［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１０， ３８（２）：６２７－６２８．

［７］余樂，蘭芹英，湯庚國．流蘇石斛種子非共生萌發(fā)的研究［Ｊ］． 福建林學(xué)院學(xué)報，２０１１，３１（４）：３４６－３４８．

［８］ 黃衛(wèi)昌，殷麗青，胡永紅，等．流蘇石斛的離體快速繁殖［Ｊ］．上海交通大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），２００８，２６（６）：５８４－５８７．

［９］ 吳明開，朱國勝，毛堂芬，等．正交試驗(yàn)優(yōu)選環(huán)草石斛組培苗壯苗生產(chǎn)工藝［Ｊ］． 激光生物學(xué)報，２００８，１７（２）：２６５－２６９．

［１０］郭益紅，孫紅杰，史冀清．蘇州地區(qū)鐵皮石斛移栽基質(zhì)優(yōu)化篩選研究［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１１，39（6）：3258-3259，3261.

（責(zé)任編輯 屠晶）

2.2流蘇石斛組培苗煉苗移栽結(jié)果

煉苗處理100 d后對流蘇石斛組培幼苗進(jìn)行統(tǒng)計。小于4 cm的組培苗成活率為90.0%，4~6 cm的組培苗成活率為86.7%，大于6 cm的組培苗成活率最高為96.7%。然后以莖粗每隔25 d的平均生長量為依據(jù)，統(tǒng)計分析3種基質(zhì)中30株莖長大于6 cm的流蘇石斛幼苗的平均莖粗（表1）。煉苗馴化25 d時，處理Ⅲ平均莖粗增長率最大為63.70%；煉苗馴化50 d時，處理Ⅲ平均莖粗增長率最大為133.09%；但馴化75 d時，處理Ⅰ平均莖粗增長率最大為203.59%，高于處理Ⅱ、Ⅲ的平均莖粗增長率；并且在100 d時，處理Ⅰ平均莖粗增長率達(dá)到208.01%，生長優(yōu)勢更為明顯。

3小結(jié)與討論

流蘇石斛種子無菌萌發(fā)適宜培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA，添加25 g/L蔗糖，6.5 g/L瓊脂，pH 5.8，種子萌發(fā)快，萌發(fā)率高；繼代培養(yǎng)適宜培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，添加25 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，200 g/L馬鈴薯泥，pH 5.8，組培苗生長旺盛；壯苗生根適宜培養(yǎng)基為改良培養(yǎng)基（WM）［9］+2 mg/L NAA，添加30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂、100 g/L香蕉汁，pH 5.6，苗壯、根系發(fā)達(dá)。

流蘇石斛作為中藥材，既可以全株入藥，也可以新鮮莖入藥，因此莖粗、株高、新根數(shù)等都是衡量產(chǎn)量的重要指標(biāo)。根據(jù)各個基質(zhì)處理的莖粗信息，處理Ⅰ中的組培苗在生長過程中莖較粗，更能促進(jìn)流蘇石斛的生長發(fā)育，其特點(diǎn)是鋸末比例較高，基質(zhì)通透性和保水保肥性比較好，更適合鐵皮石斛生長［10］。處理Ⅱ保水保肥性能較差，不適合流蘇石斛的生長。處理Ⅲ由于使用蘭花土導(dǎo)致基質(zhì)通透性變差，也不太適合流蘇石斛的生長。

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［３］ 王憲楷，趙同芳．石斛屬植物的化學(xué)成分與中藥石斛［Ｊ］．中國藥學(xué)雜志，１９８６，２１（１１）：６６６-669．

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［６］ 黃勇．流蘇石斛組織培養(yǎng)體系研究［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１０， ３８（２）：６２７－６２８．

［７］余樂，蘭芹英，湯庚國．流蘇石斛種子非共生萌發(fā)的研究［Ｊ］． 福建林學(xué)院學(xué)報，２０１１，３１（４）：３４６－３４８．

［８］ 黃衛(wèi)昌，殷麗青，胡永紅，等．流蘇石斛的離體快速繁殖［Ｊ］．上海交通大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），２００８，２６（６）：５８４－５８７．

［９］ 吳明開，朱國勝，毛堂芬，等．正交試驗(yàn)優(yōu)選環(huán)草石斛組培苗壯苗生產(chǎn)工藝［Ｊ］． 激光生物學(xué)報，２００８，１７（２）：２６５－２６９．

［１０］郭益紅，孫紅杰，史冀清．蘇州地區(qū)鐵皮石斛移栽基質(zhì)優(yōu)化篩選研究［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１１，39（6）：3258-3259，3261.

（責(zé)任編輯 屠晶）

2.2流蘇石斛組培苗煉苗移栽結(jié)果

煉苗處理100 d后對流蘇石斛組培幼苗進(jìn)行統(tǒng)計。小于4 cm的組培苗成活率為90.0%，4~6 cm的組培苗成活率為86.7%，大于6 cm的組培苗成活率最高為96.7%。然后以莖粗每隔25 d的平均生長量為依據(jù)，統(tǒng)計分析3種基質(zhì)中30株莖長大于6 cm的流蘇石斛幼苗的平均莖粗（表1）。煉苗馴化25 d時，處理Ⅲ平均莖粗增長率最大為63.70%；煉苗馴化50 d時，處理Ⅲ平均莖粗增長率最大為133.09%；但馴化75 d時，處理Ⅰ平均莖粗增長率最大為203.59%，高于處理Ⅱ、Ⅲ的平均莖粗增長率；并且在100 d時，處理Ⅰ平均莖粗增長率達(dá)到208.01%，生長優(yōu)勢更為明顯。

3小結(jié)與討論

流蘇石斛種子無菌萌發(fā)適宜培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA，添加25 g/L蔗糖，6.5 g/L瓊脂，pH 5.8，種子萌發(fā)快，萌發(fā)率高；繼代培養(yǎng)適宜培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，添加25 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，200 g/L馬鈴薯泥，pH 5.8，組培苗生長旺盛；壯苗生根適宜培養(yǎng)基為改良培養(yǎng)基（WM）［9］+2 mg/L NAA，添加30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂、100 g/L香蕉汁，pH 5.6，苗壯、根系發(fā)達(dá)。

流蘇石斛作為中藥材，既可以全株入藥，也可以新鮮莖入藥，因此莖粗、株高、新根數(shù)等都是衡量產(chǎn)量的重要指標(biāo)。根據(jù)各個基質(zhì)處理的莖粗信息，處理Ⅰ中的組培苗在生長過程中莖較粗，更能促進(jìn)流蘇石斛的生長發(fā)育，其特點(diǎn)是鋸末比例較高，基質(zhì)通透性和保水保肥性比較好，更適合鐵皮石斛生長［10］。處理Ⅱ保水保肥性能較差，不適合流蘇石斛的生長。處理Ⅲ由于使用蘭花土導(dǎo)致基質(zhì)通透性變差，也不太適合流蘇石斛的生長。

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［４］王康正，高文遠(yuǎn)．石斛屬藥用植物研究進(jìn)展［Ｊ］．中草藥，１９９７， ２８（１０）：６３３-635．

［５］劉強(qiáng)，殷壽華，黃文，等．流蘇石斛瀕危原因及資源保護(hù)［Ｊ］．亞熱帶植物科學(xué)，２００７，３６（４）：４５－４７．

［６］ 黃勇．流蘇石斛組織培養(yǎng)體系研究［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１０， ３８（２）：６２７－６２８．

［７］余樂，蘭芹英，湯庚國．流蘇石斛種子非共生萌發(fā)的研究［Ｊ］． 福建林學(xué)院學(xué)報，２０１１，３１（４）：３４６－３４８．

［８］ 黃衛(wèi)昌，殷麗青，胡永紅，等．流蘇石斛的離體快速繁殖［Ｊ］．上海交通大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），２００８，２６（６）：５８４－５８７．

［９］ 吳明開，朱國勝，毛堂芬，等．正交試驗(yàn)優(yōu)選環(huán)草石斛組培苗壯苗生產(chǎn)工藝［Ｊ］． 激光生物學(xué)報，２００８，１７（２）：２６５－２６９．

［１０］郭益紅，孫紅杰，史冀清．蘇州地區(qū)鐵皮石斛移栽基質(zhì)優(yōu)化篩選研究［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１１，39（6）：3258-3259，3261.

（責(zé)任編輯 屠晶）