尚畫雨, 夏 志, 張 丹, 黃玫梅, 上官若男, 蘇全生△

(1北京體育大學運動人體科學學院，北京 100084； 2井岡山大學體育學院，江西 吉安 343009； 3四川省體育科學研究所，4成都體育學院，四川 成都 610041； 5成都大學體育學院，四川 成都 610106)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuro-pathy, DPN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)最常見的慢性并發(fā)癥之一，在臨床上表現(xiàn)為進行性的感覺功能缺失，隨著病情的發(fā)展會出現(xiàn)疼痛、麻木甚至可能因壞疽而導致截肢[1]。目前，臨床上主要通過藥物治療DPN，但值得考慮的是，長期服藥不僅會產(chǎn)生毒副作用，且只能暫時應對部分問題，停藥后療效也無法持續(xù)。

引起DPN的發(fā)病機制有很多，近年來隨著炎癥學說的興起和研究的增多，越來越多的學者趨向認為神經(jīng)功能障礙主要是由于炎癥反應引起[2-4]。運動與“胰島素、飲食”一并被比喻為治療DM的“三駕馬車”。目前，國內(nèi)外鮮見對炎癥與DPN關系的研究，且尚未見報道從炎癥反應的角度研究長期游泳運動在DPN發(fā)病中的干預作用。本研究擬通過對DPN模型大鼠神經(jīng)組織病理學、坐骨神經(jīng)中炎癥因子和神經(jīng)電生理的檢測，探討運動對T2DM大鼠坐骨神經(jīng)損傷的保護作用及其可能機制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)(Sigma)；ELISA試劑盒(成都三鷹生物技術有限公司)；血糖儀(美國強生公司)；PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(AD Instruments)。

2 動物分組及模型制備

健康雄性Wistar大鼠45只，8周齡，體重200～230 g(四川大學華西醫(yī)學院動物中心提供)。適應性喂養(yǎng)1周后，隨機抽取14只分為空白對照組(C,n=7)和單純運動組(CE,n=7)，給予標準大鼠飼料喂養(yǎng)7周后腹腔注射相同劑量的枸櫞酸緩沖液。其余31只給予高糖高脂飼料(10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鈉，66.5%常規(guī)飼料)喂養(yǎng)(期間死亡5只)，7周后空腹12 h腹腔注射STZ 30 mg/kg(溶于0.1 mol/L、pH4.2的枸櫞酸緩沖液中)。72 h后用血糖儀檢測非禁食血糖>16.7 mmol/L者作為2型糖尿病(type II diabetes mellitus, T2DM)大鼠[5]。將20只成模大鼠(造模成功率為76.9%)隨機分為2組：DM對照組(DM,n=10)和DM+運動組(DME,n=10)。

3 運動干預方案

采用改進的Ploug等[6]訓練方案，池(100 cm×70 cm×60 cm)水深50 cm，水溫(30±2)℃。先進行2次適應性游泳練習，每次10 min。第1周前3 d訓練時間分別為20 min、30 min和45 min，第4天起每天持續(xù)游泳60 min，每周訓練6 d，共訓練8周。CE組和DME組進行訓練，C組和DM組不予運動。

4 觀察指標及檢測方法

實驗期間記錄大鼠一般情況及行為改變，定時稱重。分別于STZ注射前、運動8周后禁食12 h測量各組大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和空腹血清胰島素(fasting insulin,FINS)。使用血糖儀測定FBG，ELISA測定血清FINS；胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

運動8周后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉后，俯臥位固定，迅速脫毛，仔細分離右側從坐骨切跡至踝部的坐骨神經(jīng)。坐骨神經(jīng)分離暴露后立即測定，用生理鹽水作為導電介質(zhì)，以鉤狀電極作為刺激電極和記錄電極分別置于坐骨切跡處和踝部，另將一個參考電極置于記錄電極和刺激電極之間，大約位于腓腸肌處。測試時保持室溫(25±1)℃，大鼠體溫37 ℃左右，并連接PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(頻率20 Hz；單刺激方式；波寬1 ms；強度1.4 V；采樣速率20 kHz)[7]。運動神經(jīng)傳導速度(motornerve conduction velocity,MNCV;m/s)=刺激電極與記錄電極之間的距離(cm)×10/動作電位產(chǎn)生時間 (ms)，重復電刺激3次取平均值。MNCV測定后，取大鼠左側坐骨神經(jīng)(坐骨切跡至遠端1 cm)，行HE染色。左側剩余神經(jīng)組織迅速置于液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱備用。ELISA測定坐骨神經(jīng)中腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素6(interleukin 6, IL-6)和C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)含量。

5 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。進行方差分析之前先進行方差齊性檢驗，若方差齊，則直接采用Bonferroni法進行事后檢驗，以使結論穩(wěn)健而不保守；若方差不齊，則將原始數(shù)據(jù)轉換至齊性后再作統(tǒng)計。對于不能轉換至齊性的指標數(shù)據(jù)，直接采用Tamhane’s T2的統(tǒng)計結果進行分析。

結 果

1 一般情況

實驗期間由于環(huán)境和飲食改變、糖尿病慢性疾病狀態(tài)和感染等原因導致大鼠死亡。C、CE、DM和DME組最終進入統(tǒng)計的有效樣本量分別為6只、6只、7只和6只。

成模大鼠毛色無光澤、精神萎靡，多飲、多食、多尿，明顯消瘦。

2 體重的變化

適應性喂養(yǎng)1周后，14只標準飼料喂養(yǎng)大鼠體重[(242.00±34.52) g]與31只高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠體重[(233.30±24.87) g]無顯著差異。開始運動前C和CE組體重增加，DM和DME組體重減輕，各組間體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗末，C和CE組體重持續(xù)增加，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；DM組體重顯著低于C組和CE組(P<0.01)；DME組體重較C組和CE組明顯減輕(P<0.05)，較DM組增加并不顯著(P>0.05)，見圖1。

Figure 1. The change of body weight in diffe-rent groups at different time points. Mean±SD.n=6～7.*P<0.05, **P<0.01 vs C group; #P<0.05, ##P<0.01 vs CE group.

3 血糖的變化

實驗期間C組和CE組的空腹血糖在正常范圍內(nèi)波動且組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。DM和DME組在STZ注射前、開始運動前及運動后的空腹血糖均明顯高于C組和CE組(P<0.01或P<0.05)。開始運動前，DM組和DME組的空腹血糖比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗末，與DM組相比，DME組的空腹血糖明顯降低(P<0.05),見圖2。

Figure 2. The change of fasting blood glucose (FBG) in diffe-rent groups at different time points. Mean±SD. n=6～7.*P<0.05, **P<0.01 vs C group; #P<0.05, ##P<0.01 vs CE group; ▲P<0.05 vs DM group.

4 血清FINS和HOMA-IR的變化

實驗期間C組和CE組的血清FINS和HOMA-IR均未發(fā)生明顯變化，且組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在STZ注射前，DM和DME組的血清FINS和HOMA-IR高于C組和CE組(P<0.05或P<0.01)，但DM與DME兩組間差異不顯著(P>0.05)。實驗末，DM組的血清FINS低于C組和CE組(P<0.01)，HOMA-IR高于C組和CE組(P<0.01)；DME組的血清FINS和HOMA-IR與C組和CE組相比無顯著差異(P>0.05)，血清FINS顯著高于DM組(P<0.01)，HOMA-IR明顯低于DM組(P<0.05)，見圖3、4。

Figure 3. The change of fasting insulin (FINS) in different groups at different time points. Mean±SD. n=6～7.*P<0.05, **P<0.01 vs C group; #P<0.05, ##P<0.01 vs CE group; ▲▲P<0.01 vs DM group.

Figure 4. The change of HOMA-IR in different groups at different time points. Mean±SD. n=6～7.**P<0.01 vs C group; ##P<0.01 vs CE group; ▲P<0.05 vs DM group.

5 MNCV的變化

實驗末，C組和CE組的MNCV差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。DM和DME組的MNCV明顯低于C組和CE組(P<0.01或P<0.05)；與DM組相比，DME組的MNCV顯著提高(P<0.05),見圖5。

Figure 5. The change of MNCV in different groups. Mean±SD. n=6～7.*P<0.05, **P<0.01 vs C group; ##P<0.01 vs CE group; ▲P<0.05 vs DM group.

6 坐骨神經(jīng)形態(tài)學的變化

實驗末，C組(圖6A)和CE組(圖6B)的坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維形態(tài)正常，神經(jīng)纖維排列緊密，髓鞘正常包繞在神經(jīng)纖維軸索外。與C組和CE組比較，DM組(圖6C)表現(xiàn)出神經(jīng)損傷，髓鞘空泡變性，部分神經(jīng)纖維脫髓鞘(如箭頭所指)。DME組(圖6D)較DM組改善明顯，髓鞘空泡變性數(shù)量減少，極少神經(jīng)纖維脫髓鞘。

Figure 6. The morphological change of sciatic nerve in different groups (HE staining, ×400). A: C group; B: CE group; C: DM group; D: DME group. Black arrows show myelin damage.

7 坐骨神經(jīng)中TNF-α、IL-6和CRP的變化

實驗末，C組和CE組TNF-α、IL-6和CRP的水平無明顯差異(P>0.05)；與C組和CE組相比，DM組的TNF-α、IL-6和CRP水平明顯升高(P<0.05)，而DME組的TNF-α、IL-6和CRP水平升高不顯著(P>0.05)；DME組與DM組相比，雖然TNF-α、IL-6和CRP水平差異并不顯著(P>0.05)，但仍表現(xiàn)出了下降的趨勢，見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)炎癥因子比較

討 論

近年來，大量研究結果表明T2DM可能是一種慢性臨床炎癥性疾病，由免疫系統(tǒng)誘導、細胞因子介導[8]。細胞因子不僅能夠預測DM的發(fā)生[9-10]，而且與DM并發(fā)癥如血管病變、腎病等有關[11-13]。這些炎癥細胞因子主要包括急性時相反應蛋白CRP、TNF-α、IL-6等。研究指出：適宜的有氧運動，能明顯提高血液纖維蛋白溶解酶活性，改善微循環(huán)，增加神經(jīng)血流灌注，改善局部血液動力學，增強機體抗氧化反應，減輕炎癥反應[14]。這為有氧運動治療糖尿病并發(fā)癥提供了理論依據(jù)。

本實驗采用高糖高脂喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ注射制備T2DM模型，我們發(fā)現(xiàn)當高糖高脂喂養(yǎng)7周后大鼠出現(xiàn)高胰島素血癥和胰島素抵抗(insulin resis-tance, IR)，胰島素抵抗指數(shù)升高，繼以小劑量STZ破壞大鼠胰島功能，出現(xiàn)高血糖。結果顯示DM大鼠均呈現(xiàn)典型“三多一少”癥狀，毛色無光澤，體重明顯減輕，從而進一步說明，本研究成功建立了T2DM大鼠模型，與國內(nèi)外學者研究結果一致[15-16]。隨后，我們觀察了從T2DM發(fā)病到出現(xiàn)神經(jīng)損害的完整過程，模擬了人類DPN發(fā)病情況和病理特征。神經(jīng)傳導速度(nerve conduction velocity,NCV)是診斷周圍神經(jīng)損傷的“金指標”，也是DPN重要的檢查手段。很多實驗制備DPN動物模型進行研究，結果表明，在DM早期即出現(xiàn)NCV明顯減慢[17-18]。NCV包括MNCV和感覺神經(jīng)傳導速度(sensory NCV,SNCV)。其中，MNCV是最常用于研究實驗性DPN模型的觀察指標。本實驗在大鼠成模后立即進行運動干預，結果表明，8周游泳運動不能將血糖降至正常水平，但能有效控制體重下降和血糖升高，還能增加胰島素的分泌，從而改善IR。8周運動后DM組MNCV較C、CE組明顯減慢(P<0.01)，而DME組與DM組比較明顯提高(P<0.05)。提示8周游泳運動對T2DM大鼠MNCV減慢具有改善作用。另有資料表明，神經(jīng)病變的發(fā)生同雪旺細胞與神經(jīng)元軸突間的聯(lián)系異常緊密相關。其中，髓鞘病變與神經(jīng)傳導速度有關，而軸突病變與誘發(fā)電位的波幅有關。光鏡下我們觀察到，DM組髓鞘空泡變性顯著，部分神經(jīng)纖維脫髓鞘。DME組干預后神經(jīng)髓鞘空泡變性數(shù)量減少，極少神經(jīng)纖維脫髓鞘，提示8周游泳運動能減輕T2DM大鼠周圍神經(jīng)損傷，延緩周圍神經(jīng)病變進程，與Balducci等[19]報道的長期運動訓練可以改善DPN患者自然病程的結果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)，T2DM大鼠8周時坐骨神經(jīng)中炎癥因子TNF-α、IL-6和CRP水平明顯高于C和CE組(P<0.05)，表明此時的確處于慢性炎癥狀態(tài)，這與DM炎癥發(fā)病學說是吻合的。在慢性炎癥狀態(tài)下，肝細胞可產(chǎn)生較多CRP。目前認為肝臟CRP產(chǎn)生的主要興奮劑為IL-6。TNF-α誘導IL-6表達及其它通道激活，擴大級聯(lián)反應，增加CRP的合成。FINS受體的活性受到CRP抑制，從而產(chǎn)生IR，再一次誘導TNF-α產(chǎn)生，進而加重炎癥反應。CRP受TNF-α、IL-6等因子調(diào)控，刺激血管內(nèi)皮因子釋放，造成神經(jīng)組織血流減少，缺血甚至壞死，引起神經(jīng)傳導速度減慢及周圍神經(jīng)損傷。本實驗在8周運動干預后DME組坐骨神經(jīng)中TNF-α、IL-6和CRP水平較DM組雖無明顯差異(P>0.05)，但仍然表現(xiàn)出了降低的趨勢，提示有氧運動可以抑制炎癥反應，提高MNCV。

有氧運動對于TNF-α和CRP的影響報道不一[20-23]。這可能與不同的實驗對象以及運動的時間和強度有關。Sloan等[24]研究發(fā)現(xiàn)12周中等強度(55%～60%最大心率)有氧運動后健康成年人TNF-α水平變化不大，只有12周高強度(75%～80%最大心率)有氧運動組TNF-α 出現(xiàn)顯著下降。另有資料報道，TNF-α受體的水平比TNF-α更能反映TNF-α系統(tǒng)的活動[25]。另有研究結果顯示有氧運動并不能降低TNF-α和CRP水平，但可以改善體適能[26-27]。You等[28]以絕經(jīng)后肥胖婦女作為實驗對象，對其進行6個月的節(jié)食聯(lián)合運動干預，最后發(fā)現(xiàn)，節(jié)食聯(lián)合運動干預可以使絕經(jīng)后肥胖婦女CRP水平顯著下降，提示從事有氧運動的同時需控制飲食，這樣才能有效降低CRP水平。而IL-6未發(fā)生顯著變化可能是8周的運動時間還不足以引起IL-6水平發(fā)生明顯改變。本研究結果表明，8周游泳運動能通過降低炎癥反應而減輕T2DM大鼠周圍神經(jīng)損傷。

綜上所述，8周游泳運動可降低T2DM大鼠FBG水平，改善IR，提高MNCV，減輕DM造成的神經(jīng)損傷，對周圍神經(jīng)起保護作用，其機制可能與減輕炎癥反應有關。

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