黃 東， 陸 浩， 姚 康， 孫愛軍， 鄒云增， 葛均波

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，上海市心血管病研究所,上海 200032)

血管緊張素II(angiotensin II, Ang II)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)激活后產(chǎn)生的主要血管活性物質(zhì)，在多種心血管疾病，如高血壓、心力衰竭和冠心病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。近來的研究發(fā)現(xiàn)，Ang II還與很多炎癥性疾病，如免疫介導(dǎo)的腎小球腎炎、移植物排斥、關(guān)節(jié)炎等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2]。另一方面，在免疫過程中起重要抗原遞呈作用及免疫調(diào)節(jié)作用的樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中的作用受到廣泛關(guān)注[3]。然而，Ang II對樹突狀細(xì)胞分化及免疫功能的影響仍不清楚。本研究擬通過體外觀察Ang II對人單核細(xì)胞源樹突狀細(xì)胞免疫成熟進(jìn)程及其攝取氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL)功能的影響，以初步探討Ang II參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

濃縮白細(xì)胞由上海市血液中心提供。CD14+免疫磁珠及相關(guān)產(chǎn)品購自Milteny Biotech。白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-12和干擾素(interferon, IFN)-γ的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒購自R&D。淋巴細(xì)胞分離液(Histopaque-1077)購自Sigma。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco。重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,rhGM-CSF)和重組人IL-4(recombinant human interleukin-4, rhIL-4)購自R&D。Ang II和血管緊張素II受體1拮抗劑(angiotensin II receptor 1 antagonist, ARB)洛沙坦購自Sigma。FITC熒光標(biāo)記的抗人單克隆抗體CD83和人類白細(xì)胞抗原DR(human leukocyte antigen DR, HLA-DR)購自BD。Trizol試劑和SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen。GoTaq qPCR Master Mix購自Promega。熒光DiI標(biāo)記的氧化低密度脂蛋白(DiI-labelled oxidized low-density lipoprotein, DiI-Ox-LDL)購自北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司。

2 DCs的培養(yǎng)及分組[1]

取正常人外周血單采白細(xì)胞，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離出單個(gè)核細(xì)胞，PBS重懸后加入Fc拮抗劑和CD14+免疫磁珠，4 ℃孵育20 min，經(jīng)分離柱流洗，分選出純度大于98%的CD14+單核細(xì)胞，加入含有10%胎牛血清、100 μg/L rhGM-CSF和50 μg/L rhIL-4的RPMI-1640培養(yǎng)液，隔天換液。在細(xì)胞培養(yǎng)的第6天分別加入不同終濃度的Ang II(1、10、100 nmol/L)干預(yù)24 h，以PBS作為陰性對照。在細(xì)胞培養(yǎng)的第5天加入10 μmol/L洛沙坦預(yù)干預(yù)24 h，然后加入100 nmol/L Ang II干預(yù)24 h，以PBS作為陰性對照。每日觀察細(xì)胞生長情況，干預(yù)結(jié)束后收集懸浮細(xì)胞和上清。

3 DCs免疫表型和細(xì)胞因子的檢測

收集干預(yù)的DCs，用PBS清洗后重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108/L，分別加入FITC熒光標(biāo)記的抗人單克隆抗體CD83和HLA-DR，4 ℃孵育30 min，PBS洗2次后，加2%多聚甲醛固定，置4 ℃避光保存，24 h內(nèi)用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測，CellQuest軟件分析檢測結(jié)果。

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，儲(chǔ)存于-70 ℃冰箱，按照說明書用ELISA檢測試劑盒測定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ的濃度。

4 Real-time PCR檢測清道夫受體mRNA的表達(dá)

收集干預(yù)的DCs，采用Trizol試劑常規(guī)方法抽提總RNA，分光光度法測定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。取5 μg總RNA以oligo-dT為引物，SuperScript III RT為逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋后作為模板進(jìn)行3種清道夫受體[清道夫受體A(scavenger receptor A,SR-A)、CD36和凝集素樣Ox-LDL受體1(lectin-like Ox-LDL receptor 1, LOX-1)]的PCR擴(kuò)增，其引物序列分別為：SR-A上游引物5’-TCCTCGTGTTTGCAGTTCTC-3’，下游引物5’-GCAATTCTTCGTTTCCCACT-3’；CD36上游引物5’-CGCTGAGGACAACACAGTCT-3’，下游引物5’-GTTGTCAGCCTCTGTTCCAA-3’；LOX-1上游引物5’-GGGCTCATTTAACTGGGAAA-3’，下游引物 5’-GAAATTGCTTGCTGGATGAA-3’。采用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR 反應(yīng)，mRNA的表達(dá)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分析。

5 Ox-LDL的攝取

為了檢測DCs對Ox-LDL的攝取，收集干預(yù)的DCs，用PBS清洗后重懸，各組細(xì)胞加入10 mg/L的熒光標(biāo)記的DiI-Ox-LDL，37 ℃孵育60 min，PBS洗3次后，用流式細(xì)胞儀檢測DiI-Ox-LDL的攝取分?jǐn)?shù)。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，LSD法進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AngⅡ和洛沙坦對DCs免疫表型和分泌細(xì)胞因子的影響

收集干預(yù)24 h的懸浮細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表型分析顯示，與陰性對照PBS組相比，Ang II干預(yù)后細(xì)胞表達(dá)CD83和HLA-DR明顯增加，且呈濃度依賴性升高。與濃度為100 nmol/L Ang II干預(yù)的DCs相比，10 μmol/L洛沙坦預(yù)處理可明顯抑制Ang II誘導(dǎo)的CD83、HLA-DR表面分子的表達(dá)，見圖1A、B。通過ELISA法對細(xì)胞培養(yǎng)上清液定量檢測表明，與PBS組相比，Ang II干預(yù)后DCs分泌IL-12和IFN-γ水平明顯升高，且呈濃度依賴性，同樣10 μmol/L洛沙坦預(yù)處理可明顯減弱Ang II誘導(dǎo)的DCs分泌IL-12和IFN-γ，見圖1C、D。

Figure 1. Immunophenotypic expression and cytokine secretion in DCs exposed to Ang II and losartan. Flow cytometric analysis was performed for surface HLA-DR (A) and CD83 (B) expression examinations. The concentrations of IL-12 (C) and IFN-γ (D) in the supernatants of the culture were measured by ELISA.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs 1 nmol/L Ang II；△P<0.05 vs 10 nmol/L Ang II;▲P<0.05 vs 100 nmol/L Ang II.

2 AngⅡ和洛沙坦對DCs攝取Ox-LDL的影響

與對照組相比，Ang II干預(yù)可呈濃度依賴性促進(jìn)DCs對DiI-Ox-LDL的攝取。而在100 nmol/L Ang II基礎(chǔ)上，10 μmol/L洛沙坦預(yù)處理可部分抑制DCs對DiI-Ox-LDL的攝取，見圖2。

Figure 2. Effects of Ang II and losartan on the uptake of DiI-Ox-LDL by DCs.

3 AngⅡ和洛沙坦對DCs清道夫受體mRNA表達(dá)的影響

Ang II干預(yù)可呈濃度依賴性上調(diào)LOX-1的表達(dá)，但對SR-A和CD36的表達(dá)無明顯影響，見圖3。與100 nmol/L Ang II干預(yù)相比，10 μmol/L洛沙坦預(yù)處理可明顯抑制LOX-1的表達(dá)，但對SR-A和CD36的表達(dá)無明顯影響，見圖3。

討 論

1 Ang II參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制

目前已有大量研究表明RAS參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEI)及ARB類藥物有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[4]。Ang II是RAS激活后產(chǎn)生的主要血管活性物質(zhì)，主要通過其2種受體，即1型受體(angiotensin II type 1 receptor, AT1)和2型受體(angiotensin II type 2 receptor, AT2)，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。目前已知的大部分Ang II的作用，包括血管收縮、醛固酮釋放、心肌和血管壁細(xì)胞的生長和增殖等促動(dòng)脈粥樣硬化的絕大部分作用，都是通過與AT1受體結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的[2]。近來的研究發(fā)現(xiàn)Ang II除可引起血管收縮，導(dǎo)致高血壓，繼發(fā)性引起動(dòng)脈粥樣硬化以外，還具有致炎癥作用，可引起內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生黏附分子和趨化因子升高，促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞浸潤，能刺激平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生IL-6等細(xì)胞因子[5]，從而提出了Ang II致炎癥作用參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的新觀點(diǎn)。

Figure 3. Effects of Ang II and losartan on the mRNA expression of SR-A, CD36 and LOX-1 analyzed by real-time PCR.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs 1 nmol/L Ang II;△P<0.05 vs 10 nmol/L Ang II;▲P<0.05 vs 100 nmol/L Ang II.

近年來的研究已證實(shí)在免疫過程中起重要抗原遞呈作用及免疫調(diào)節(jié)作用的DCs參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[3]。多種致動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素，如Ox-LDL、尼古丁和晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycosylation end products,AGEs)等都可通過促使DCs免疫功能成熟，參與并放大動(dòng)脈粥樣硬化炎癥免疫反應(yīng)[6-7]。其中DCs的成熟是其發(fā)揮免疫作用的關(guān)鍵。成熟DCs表達(dá)高水平的HLA-DR、CD80、CD83和CD86，還可通過分泌細(xì)胞因子，如IL-12、IFN-γ和IL-10等調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞的分化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)Ang II可濃度依賴性活化DCs，促進(jìn)其免疫成熟，表現(xiàn)在其細(xì)胞表面成熟標(biāo)志(HLA-DR和CD83)的表達(dá)增加，分泌多種細(xì)胞因子增加，從而使其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，這可能是Ang II致炎癥促動(dòng)脈粥樣硬化的一種新機(jī)制。而這些作用可被ARB類藥物洛沙坦所抑制，提示AT1的激活是Ang II發(fā)揮作用的主要受體。

2 Ang II與Ox-LDL在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的新聯(lián)系

我們既往的研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起核心作用的危險(xiǎn)因素——Ox-LDL除了可以促進(jìn)DCs的活化和免疫成熟外，DCs還可吞噬Ox-LDL形成泡沫細(xì)胞，可能是除單核-巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞以外泡沫細(xì)胞的一個(gè)新來源[6]。而本研究發(fā)現(xiàn)Ang II可促進(jìn)DCs對Ox-LDL的攝取，從而可能促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成，這也是Ang II促動(dòng)脈粥樣硬化的另一新機(jī)制，并且提供了Ang II與Ox-LDL這2種危險(xiǎn)因素在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中相互促進(jìn)、存在密切聯(lián)系的新證據(jù)。

由于DCs攝取Ox-LDL依賴其與細(xì)胞表面的清道夫受體結(jié)合，因此為進(jìn)一步探討Ang II促進(jìn)DCs攝取Ox-LDL的機(jī)制，我們檢測了DCs表面清道夫受體(scavenger receptor，SR)的表達(dá)。傳統(tǒng)的SR包括SR-A、CD36、CD68和SR-EC等，它們主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞表面，是這些細(xì)胞攝取Ox-LDL的主要受體，參與泡沫細(xì)胞的形成。近年來一種新型的Ox-LDL的特異性受體——LOX-1越來越受到人們的重視。其結(jié)構(gòu)不同于傳統(tǒng)的SR，表達(dá)于參與動(dòng)脈粥樣硬化的多種細(xì)胞表面(如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)，是內(nèi)皮細(xì)胞攝取Ox-LDL的主要受體[8]。最近的研究發(fā)現(xiàn)在DCs表面存在多種清道夫受體的表達(dá)，其中LOX-1參與了抗原和脂質(zhì)提呈的過程[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)Ang II可上調(diào)DCs表面LOX-1的表達(dá)，且可被洛沙坦阻斷，但Ang II和洛沙坦對SR-A和CD36的表達(dá)無影響。這提示LOX-1，而不是傳統(tǒng)的清道夫受體SR-A和CD36，可能在Ang II促進(jìn)DCs攝取Ox-LDL中起重要作用。Ang II可通過活化AT1受體，上調(diào)LOX-1的表達(dá)，促進(jìn)DCs對Ox-LDL的攝取，這可能是Ang II除直接促進(jìn)DCs的免疫成熟以外，通過DCs發(fā)揮促動(dòng)脈粥樣硬化作用的另一新機(jī)制，也是提供RAS活化與血脂異常之間聯(lián)系的新證據(jù)。

綜上所述，Ang II是DCs免疫成熟的重要刺激因素，并且可能通過上調(diào)LOX-1的表達(dá)，促進(jìn)DCs對Ox-LDL的攝取，這可能是Ang II促動(dòng)脈粥樣硬化的新機(jī)制。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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