劉 曄， 彭 力， 盧圣霞， 杜月娟， 劉元濤△， 傅余芹△

(山東大學(xué)第二醫(yī)院 1腎臟內(nèi)科， 2內(nèi)分泌科，山東 濟(jì)南 250033；3山東電力中心醫(yī)院內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250002; 4濟(jì)南市中心醫(yī)院腎臟內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250013)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病致死致殘的重要原因。近年的研究表明，足突細(xì)胞損傷在糖尿病腎病的發(fā)生尤其是蛋白尿的形成過程中具有關(guān)鍵作用[1]。Wnt/β-catenin是細(xì)胞內(nèi)高度保守的信號通路，參與腎臟在胚胎階段的發(fā)生發(fā)育。目前研究發(fā)現(xiàn)，在成人腎臟病，包括急性腎損傷、腎小球疾病、糖尿病腎病等，該途徑被異常激活并參與足突細(xì)胞損傷的病理過程[2]。緊密連接蛋白2(zonula occludens-2，ZO-2)屬于膜相關(guān)鳥苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinase 3β，MAGUK)蛋白家族成員，作為骨架蛋白其廣泛存在于體內(nèi)上皮細(xì)胞的緊密連接處及增殖期細(xì)胞核內(nèi)，參與多種途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。已有研究發(fā)現(xiàn)ZO-2存在于腎小球足突細(xì)胞中，氧化應(yīng)激反應(yīng)可能影響其表達(dá)并可能參與調(diào)控Wnt/β-catenin通路[3]。

硫化氫(H2S)是繼一氧化碳(carbonic oxide，CO)和一氧化氮(nitric oxide，NO)之后發(fā)現(xiàn)的新型氣體信號分子。哺乳動物體內(nèi)以L-半胱氨酸為底物，通過激活5’-磷酸吡哆醛依賴性酶：胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)和胱硫醚 β-合成酶(cystathionine β-synthase，CBS)生成H2S[4]。CBS和CSE在哺乳動物組織和細(xì)胞中分布廣泛[5]。CBS主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)，而CSE主要分布于外周系統(tǒng)，尤其是肝、腎及血管系統(tǒng)[6]。最近，有研究發(fā)現(xiàn)H2S對糖尿病大鼠腎臟病變具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)系統(tǒng)的激活有關(guān)[7]。然而，硫化氫對高糖導(dǎo)致的足突細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用？目前尚未見報道。本文擬觀察硫化氫在高糖誘導(dǎo)的腎小球足突細(xì)胞損傷中的作用，并探討其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

小鼠足細(xì)胞系MPC5由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院易凡教授惠贈。無糖RPMI-1640培養(yǎng)基和新生胎牛血清，D-葡萄糖，CSE特異性抑制劑DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine，PPG)及NaHS；兔抗ZO-2、兔抗CSE、小鼠抗β-catenin、抗nephrin、抗β-actin及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠II抗，ECL發(fā)光液，BCA試劑盒，膠片。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將MPC5細(xì)胞接種于含5.5 mmol/L葡萄糖、1×104U/L γ-干擾素、10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，33 ℃、5% CO2培養(yǎng)，在γ-干擾素的作用下傳代增生。繼而置于不含γ-干擾素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)10～14 d使其分化成熟，2～3 d換液，待細(xì)胞融合至80%左右，無血清培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化。同步化細(xì)胞分組：高糖組(30 mmol/L葡萄糖)；正常糖組：5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇;正常糖(5.5 mmol/L葡萄糖)+24.4 mmol/L甘露醇+PPG(0.1 mmol/L)；正常糖(5.5 mmol/L葡萄糖)+23.5 mmol/L甘露醇+PPG(1 mmol/L)；正常糖(5.5 mmol/L葡萄糖)+14.5 mmol/L甘露醇+PPG(10 mmol/L)；高糖(30 mmol/L葡萄糖)+ NaHS(100 μmol/L)組。于各處理時點(diǎn)，收集細(xì)胞并進(jìn)行Western blotting分析。

2.2Western blotting 細(xì)胞經(jīng)處理后，用PBS沖洗2遍，冰上裂解，裂解液：20 mmol/L Tris-HCl， 0.1 mmol/L Na3VO4，25 mmol/L NaF，25 mmol/L β-磷酸甘油，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，2 mg/L 抑肽酶(aprotinin)，2 mg/L亮抑蛋白酶肽(leupeptin)，pH 7.5。4 ℃條件下離心15 min(14 000 r/min)，取上清并用BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白(20 μg)上樣，經(jīng)10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃條件下，I抗孵育12 h，TBST充分洗膜后，1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記II抗室溫雜交1 h。TBST洗膜，ECL顯色，結(jié)果定量分析用NIH ImageJ 1.42軟件處理。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較用Newman-Keuls檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高糖對足突細(xì)胞nephrin、ZO-2和β-catenin表達(dá)的影響

高糖(30 mmol/L)處理12 h，足突細(xì)胞nephrin及ZO-2蛋白水平顯著降低，48 h降至最低；β-catenin蛋白水平12 h顯著升高(P<0.05)，48 h達(dá)到高峰(P<0.01),見圖1。

Figure 1. Effects of high glucose (HG,30 mmol/L) on nephrin，ZO-2 and β-catenin protein expression at different time points. Mean±SD. n=3. △P<0.05，△△P<0.01 vs HG 0 h group.

2 高糖對CSE蛋白表達(dá)的影響

與NG組相比，HG組CSE的表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，48 h降至最低(P<0.01),見圖2。

Figure 2. The effect of high glucose (HG,30 mmol/L) on expression of CSE at 0 h，12 h，24 h and 48 h. Mean±SD. n=3. △P<0.05,△△P<0.01 vs HG 0 h group.

3 PPG對小鼠足突細(xì)胞nephrin、ZO-2及β-catenin的影響

對正常糖濃度培養(yǎng)的足突細(xì)胞，分別給予不同濃度的PPG處理48 h,PPG可顯著抑制nephrin和ZO-2的表達(dá)(P<0.05)，并具有濃度依賴性；而同時顯著增加β-catenin的蛋白表達(dá)水平(P<0.05),見圖3。

Figure 3. Effects of different concentrations of PPG on the expression of nephrin，ZO-2 and β-catenin at 48 h. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs NG group.

4 NaHS對高糖培養(yǎng)的足突細(xì)胞nephrin、ZO-2及β-catenin表達(dá)的影響

與NG組相比，HG處理48 h nephrin和ZO-2的表達(dá)量明顯減少(P<0.01)，β-catenin的表達(dá)量明顯增加(P<0.01)；HG+NaHS組nephrin和ZO-2蛋白水平較HG組顯著增加(P<0.01)，但仍低于NG組(P<0.01)；β-catenin較HG明顯減少(P<0.01)，但仍高于NG組(P<0.01),見圖4。

討 論

蛋白尿是糖尿病腎病重要的臨床表現(xiàn)，是臨床診斷的重要指標(biāo)，從早期的微量白蛋白尿到中晚期的大量蛋白尿均可使腎功能進(jìn)行性惡化。糖代謝異常是糖尿病腎病足突細(xì)胞病變的始動因素，高血糖可以使腎小球?yàn)V過膜的通透性增加[8]，足突細(xì)胞是腎小球?yàn)V過膜的最后一道屏障，兼有大小選擇性和電荷選擇性，其病變可導(dǎo)致大分子血漿蛋白從腎小球漏出，大量蛋白的漏出又會加重足突細(xì)胞損傷和腎小球硬化。足突細(xì)胞的脫落和凋亡明顯落后于蛋白尿的產(chǎn)生，這提示受高糖刺激后，足突細(xì)胞分子水平損傷的觸發(fā)最后導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生。Nephrin由NPHS1編碼，是足突細(xì)胞裂孔膜的標(biāo)記蛋白之一，與白蛋白從濾過膜的濾出密切相關(guān)，其下調(diào)還可進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球硬化和腎功能惡化[9]，是足突細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志性蛋白，已有研究表明其下調(diào)可能與Wnt/β-catenin通路的異常激活有關(guān)[10]。

Figure 4. The effect of hydrogen sulfide on protein levels of nephrin， ZO-2 and β-catenin at 48 h. Mean±SD. n=3. △△P<0.01 vs NG group；##P<0.01 vs HG group.

Wnt信號通路在足突細(xì)胞損傷和蛋白尿形成中起關(guān)鍵作用，在Wnt缺乏時，轉(zhuǎn)錄激活因子和黏著連接的連接蛋白β-catenin與軸蛋白、大腸腺瘤樣息肉蛋白和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)結(jié)合成復(fù)合體存在于胞質(zhì)中，GSK3β可以磷酸化β-catenin并使其降解，細(xì)胞內(nèi)β-catenin含量較低；當(dāng)該通路被激活時，作為胞外配體的Wnt與細(xì)胞表面的Frizzled受體和共受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白結(jié)合，GSK3β被磷酸化失活，β-catenin無法被泛素化而不能降解，胞漿中富集的β-catenin移位至核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子LEF/TCF一起激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。在足突細(xì)胞中，如Wnt1等多種Wnt家族蛋白表達(dá)的增多，抑制了β-catenin的磷酸化，胞內(nèi)富集的β-catenin可活化表達(dá)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子snail，進(jìn)而抑制nephrin的表達(dá)導(dǎo)致足突細(xì)胞功能障礙[11-12]，最新研究顯示，ZO-2可能參與調(diào)控Wnt通路[3,13]。

ZO-2是廣泛表達(dá)在上皮細(xì)胞緊密連接處及核內(nèi)的骨架蛋白，帶有多個膜相關(guān)鳥苷酸激酶特征性的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，包括3個PDZ結(jié)構(gòu)域，1個SH3結(jié)構(gòu)域，1個GuK結(jié)構(gòu)域[3]，作用廣泛，比如，可以將緊密連接閉合蛋白和封閉蛋白結(jié)合在肌動蛋白骨架上，能與黏著連接的α-連環(huán)蛋白、縫隙連接蛋白36和43以及其它緊密連接蛋白如ZO-1、扣帶蛋白結(jié)合。在腎臟，ZO-2存在于腎小球足突細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中，與ZO-1不同的是，在腎小球ZO-2與巢蛋白(nestin)共定位于足突細(xì)胞的足突上，目前已知其與體內(nèi)多種細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤和氧化應(yīng)激相關(guān)[13-14]。有研究指出，ZO-2可抑制GSK3β被磷酸化，促進(jìn)β-catenin在胞質(zhì)中的累積，防止nephrin的丟失，避免足突細(xì)胞大規(guī)模融合或丟失[3,13]。這可能是足突細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致蛋白尿形成的重要機(jī)制之一。

腎臟的內(nèi)源性H2S通過半胱氨酸由CBS、CSE和3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶催化作用產(chǎn)生[15]，具有強(qiáng)大的抗氧化、抗凋亡和抗炎作用，Yuan[16]等研究發(fā)現(xiàn)，硫化氫可以改善高糖條件下產(chǎn)生的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)對腎小球系膜細(xì)胞的損傷，高糖環(huán)境影響降低NAPDH氧化酶這類促進(jìn)ROS產(chǎn)生的酶類活性，打破了氧化還原反應(yīng)的平衡，使硫化氫生成減少，足突細(xì)胞是否含有合成內(nèi)源性H2S的酶類及其對足細(xì)胞的作用機(jī)制目前仍不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)的足突細(xì)胞表達(dá)nephrin明顯減少，提示高糖可導(dǎo)致足突細(xì)胞的損傷，我們繼而觀察了ZO-2和β-catenin的變化，結(jié)果表明高糖刺激顯著降低了ZO-2的表達(dá)，激活了Wnt/β-catenin通路，這與既往研究結(jié)果一致。CSE是體內(nèi)產(chǎn)生硫化氫所必需的酶類，業(yè)已證實(shí)其在腎臟中高表達(dá)，細(xì)胞水平上已證實(shí)系膜細(xì)胞中存在CSE，而足突細(xì)胞中是否存在還未證實(shí)。我們研究證實(shí)在足突細(xì)胞中有CSE表達(dá)，此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高糖在抑制nephrin表達(dá)的同時，也降低了CSE的表達(dá)水平。為了明確高糖誘導(dǎo)的CSE降調(diào)節(jié)是否與足突細(xì)胞損傷有關(guān)， 我們進(jìn)一步觀察了CSE特異性抑制劑PPG對nephrin表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSE特異性抑制劑顯著降低了正常糖條件下的小鼠足突細(xì)胞的nephrin表達(dá)，且具有劑量依賴性，從而提示高糖誘導(dǎo)的CSE降調(diào)節(jié)可能是造成足突細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。此外，我們以100 μmol/L NaHS[17-18]作為硫化氫的供體處理細(xì)胞，結(jié)果顯示NaHS對高糖誘導(dǎo)的Nephrin降調(diào)節(jié)具有顯著抑制作用，提示外源性硫化氫對高糖環(huán)境下的小鼠足突細(xì)胞損傷具有一定的防治作用。

為了探討硫化氫的作用機(jī)制，我們觀察了CSE特異性抑制劑對ZO-2及Wnt/β-catenin通路的影響，結(jié)果提示CSE特異性抑制劑可顯著抑制ZO-2表達(dá)，而增加β-catenin的蛋白水平。與之相反，外源性硫化氫則顯著抑制了高糖誘導(dǎo)的ZO-2降調(diào)節(jié)及β-catenin蛋白水平的升高。以上結(jié)果提示，硫化氫對高糖誘導(dǎo)足突細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能是通過對ZO-2蛋白的表達(dá)調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的，但詳細(xì)機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討?？傊?，本研究結(jié)果提示高糖誘導(dǎo)的足突細(xì)胞CSE表達(dá)降低可能是足突細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一。而外源性硫化氫對高糖誘導(dǎo)的足突細(xì)胞損傷具有一定保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增加ZO-2蛋白表達(dá)、抑制Wnt/β-catenin通路有關(guān)。本研究為糖尿病腎病的防治提供了新的思路，而本研究結(jié)果有待體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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