嚴(yán)廣東， 李自成， 李健豪， 張?jiān)谟拢?趙善雋， 張穩(wěn)柱△

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心內(nèi)科, 廣東 廣州 511400;2暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科, 廣東 廣州 510630)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)及繼發(fā)的心力衰竭嚴(yán)重威脅著人們的生活質(zhì)量和生命健康，尤其是伴有糖尿病者。糖尿病(diabetes mellitus, DM)人群中急性心肌梗死及繼發(fā)心力衰竭、猝死的發(fā)生率明顯增加，其AMI預(yù)后明顯不及非糖尿病者[1-2]。研究表明，AMI后心功能的惡化主要與心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡等所致的心室重構(gòu)有關(guān)，且心肌細(xì)胞凋亡與心室重構(gòu)間可相互加重[3]。他汀類藥物是指南強(qiáng)烈推薦的調(diào)脂藥，其不僅具有調(diào)脂作用，還具有抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激、改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊等多種獨(dú)立于調(diào)脂作用外的“多效性”[4-5]。近年來(lái)，有臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，他汀類藥物可以抑制AMI后心室重構(gòu)及心功能惡化[6]，而以往研究大多針對(duì)于非糖尿病，目前涉及糖尿病AMI后心肌細(xì)胞凋亡、心室重構(gòu)及心功能能否從他汀干預(yù)中獲益的研究較少。其實(shí)，他汀類藥物改善心功能的具體機(jī)制尚不明確，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)通路是影響心肌纖維化、細(xì)胞凋亡及心室重構(gòu)關(guān)鍵的信號(hào)通路之一。既往研究顯示，HGF不僅表達(dá)于肝臟，其在心臟、腎臟均有表達(dá)，可通過(guò)作用其心臟上的受體c-Met，發(fā)揮抗炎、抗心肌纖維化、抗心肌細(xì)胞凋亡及促血管再生等作用，改善心室重構(gòu)及心功能[7]。然而，他汀類藥物對(duì)AMI后心室重構(gòu)及心功能的影響是否與HGF/c-Met信號(hào)通路有關(guān)，既往未見(jiàn)報(bào)道。本研究將觀察他汀類藥物對(duì)糖尿病大鼠AMI后心肌細(xì)胞凋亡、心室重構(gòu)及心功能的影響，并探討其作用是否與 HGF/c-Met信號(hào)通路有關(guān)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(8周齡，體重200～250 g)70只，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)為SCXK(粵)2008-0002。

1.2主要試劑與儀器 鏈脲霉素(streptozotocin，STZ)購(gòu)自上海寶曼生物科技有限公司；末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒購(gòu)自Roche；抗HGF多克隆抗體、抗c-Met多克隆抗體購(gòu)自SAB；HGF及c-Met實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)逆轉(zhuǎn)錄引物購(gòu)自上海GenePharm公司，cDNA試劑盒購(gòu)自Fermentas；Philip公司ATL-HDI5000多普勒心臟彩超儀。

2 方法

2.1建立鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型 采用一次性腹腔內(nèi)注射STZ法(65 mg/kg，溶于0.1 mmol/L、pH 4.5的檸檬酸鈉緩沖液)制備1型糖尿病大鼠模型。于STZ注射后3 d、7 d、30 d和8周時(shí)，用便攜式血糖儀(拜耳公司)檢測(cè)血糖。血糖≥16.7 mmol/L，具有多尿、多飲、多食、消瘦及毛色灰暗的大鼠入選本研究。血糖不達(dá)標(biāo)，即<16.7 mmol/L的大鼠從本研究中剔除。

2.2急性心肌梗死大鼠模型的建立及分組 誘導(dǎo)糖尿病后8周時(shí)，對(duì)糖尿病大鼠構(gòu)建急性心肌梗死模型。假手術(shù)組11只僅在相應(yīng)左冠狀動(dòng)脈部位處穿線但不結(jié)扎。AMI術(shù)后存活32只大鼠隨機(jī)分為2組：AMI對(duì)照組(n=16)和阿托伐他汀干預(yù)組(n=16, 20 mg·kg-1·d-1)。于術(shù)后24 h始，阿托伐他汀干預(yù)組予以相應(yīng)劑量阿托伐他汀(立普妥，輝瑞公司)溶于3 mL生理鹽水中灌胃，AMI對(duì)照組和假手術(shù)組均予以等量生理鹽水灌胃，治療時(shí)間共計(jì)2周。

2.3心臟彩超檢測(cè) 治療2周后，大鼠經(jīng)10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，采用ATL-HDI5000多普勒心臟彩超儀(10 MHz探頭)測(cè)定左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左室長(zhǎng)軸縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening, FS)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter, LVDd)和左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter, LVDs),取5個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期的平均值。

2.4血脂的檢測(cè) 心臟彩超檢測(cè)完成后，即刻對(duì)麻醉大鼠開(kāi)胸，暴露心臟經(jīng)心室取血3 mL，分離血清(KDC-160HR離心機(jī)，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min),使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)。

2.5心肌組織標(biāo)本采集 采血完成后，取出心臟去除心房，沿心臟長(zhǎng)軸將左心室分為兩部分，靠近心尖一側(cè)心肌制作病理切片，用于形態(tài)學(xué)檢測(cè)(HE染色和Masson染色)、心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)及免疫組化檢測(cè)；余下部分去除梗死區(qū)域后置于-80 ℃液氮中，用于real-time PCR檢測(cè)。

2.6病理切片分析

2.6.1HE染色和Masson染色 (1)HE染色：觀察糖尿病大鼠心肌梗死后心肌組織病理學(xué)改變；(2)Masson染色：可將膠原纖維染成藍(lán)色、心肌纖維染成紅色，在光學(xué)顯微鏡下(×100)隨機(jī)選取5個(gè)梗死周邊區(qū)視野進(jìn)行觀察，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，測(cè)定心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction, CVF)，即膠原面積/(膠原面積+心肌面積)。

2.6.2心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 采用TUNEL標(biāo)記法標(biāo)記心肌細(xì)胞凋亡，光鏡下觀察正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈深淺不一的顆粒狀棕黃色，即為陽(yáng)性反應(yīng)。凋亡細(xì)胞的半定量分析：在400倍光鏡下，每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)，取其平均值作為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index)。

2.6.3免疫組化檢測(cè)心肌組織中HGF和c-Met蛋白的表達(dá) 抗HGF多克隆抗體稀釋度為1∶100，抗c-Met多克隆抗體稀釋度為1∶150,陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200)以求出積分吸光度值(integral absorbance,IA)，各組間的蛋白表達(dá)采用IA值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.7Real-time PCR檢測(cè)心肌組織中HGF和c-Met mRNA的表達(dá) 采用Trizol法提取心肌組織中的總RNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內(nèi)參照。HGF上游引物5′-GAGAGAGGCGAGGAGAAACG-3′，下游引物5′-GTGTAGCCCCAGCCGTAAAT-3′；c-Met上游引物5′-ACGTACGGTGTCTCCAGCAT-3′，下游引物5′-CTGGAGACACAGGATAGGAA-3′；GAPDH上游引物5′-CTCAGTTGCTGAGGAGTCCC-3′，下游引物5′-ATTCGAGAGAAGGGAGGGCT-3′。合成cDNA后，在R1011122 Rotor-Gene 熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)結(jié)束后，以目的基因的拷貝數(shù)/內(nèi)參照的拷貝數(shù)為各基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，利用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)。組間差異采用單因素方差分析，方差齊時(shí)組間多重比較用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Dunnett’s T3檢驗(yàn)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

AMI后2周，各組存活大鼠：假手術(shù)組9只，AMI對(duì)照組10只，阿托伐他汀干預(yù)組12只。存活大鼠進(jìn)行心臟彩超、組織學(xué)、HGF和c-Met mRNA及蛋白檢測(cè)。

1 各組大鼠心功能的比較

大鼠心臟彩超檢測(cè)，AMI對(duì)照組及阿托伐他汀干預(yù)組大鼠LVEF和FS明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，LVDd和LVDs明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)AMI模型構(gòu)建成功；阿托伐他汀干預(yù)組大鼠LVEF和FS高于AMI對(duì)照組，LVDd和LVDs低于AMI對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

Figure 1. Echocardiography of rats from different groups. A: sham; B: AMI; C: AMI+atorvastatin.

表1 各組大鼠心臟彩超檢測(cè)參數(shù)的比較

2 各組大鼠血糖、血脂的比較

2周后3組糖尿病大鼠體重、血糖及血脂水平變化如表2所示，各組間體重、血糖及各項(xiàng)血脂水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 心肌組織病理學(xué)改變

HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)則，走向好，無(wú)肌絲斷裂，細(xì)胞間隙均勻，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；AMI對(duì)照組具有明顯較大面積的梗死區(qū)，心肌細(xì)胞顯著減少、肌絲斷裂、結(jié)構(gòu)紊亂，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；阿托伐他汀干預(yù)組與AMI對(duì)照組比較，其心肌細(xì)胞變性減少、結(jié)構(gòu)紊亂減輕及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，見(jiàn)圖2。

表2 各組大鼠體重、血糖、血脂水平的比較

Masson染色結(jié)果顯示，AMI對(duì)照組及阿托伐他汀干預(yù)組發(fā)生心肌纖維化程度均較假手術(shù)組明顯，但阿托伐他汀干預(yù)組的心肌纖維化的程度較AMI對(duì)照組明顯減輕(P<0.05)，見(jiàn)圖2。各組的CVF值見(jiàn)圖2。

4 心肌細(xì)胞的凋亡

TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，假手術(shù)組見(jiàn)少量心肌細(xì)胞凋亡，AMI對(duì)照組和阿托伐他汀干預(yù)組心肌細(xì)胞凋亡均較假手術(shù)組明顯，他汀干預(yù)組心肌細(xì)胞凋亡較AMI對(duì)照組明顯減輕(P<0.05)，TUNEL染色圖及各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)見(jiàn)圖3。

Figure 3. TUNEL staining (×400) of the myocardial tissue (the upper figure) and comparison of myocardial apoptotic index among the 3 groups (the lower fi-gure). A: sham; B: AMI; C: AMI+atorvastatin. Mean±SD. *P<0.05 vs sham; #P<0.05 vs AMI.

5 心肌組織中HGF及c-Met mRNA表達(dá)的比較

采用real-time PCR檢測(cè)心肌組織中HGF及c-Met mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示，AMI對(duì)照組及阿托伐他汀干預(yù)組均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05), 阿托伐他汀干預(yù)組的HGF及c-Met mRNA表達(dá)高于AMI對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4. Comparison of HGF and c-Met mRNA among the 3 groups. Mean±SD. *P<0.05 vs sham; #P<0.05 vs AMI.

6 心肌組織中HGF及c-Met蛋白表達(dá)的比較

免疫組化檢測(cè)心肌組織中HGF及c-Met蛋白表達(dá)情況如圖5所示，AMI對(duì)照組及阿托伐他汀干預(yù)組均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05), 阿托伐他汀干預(yù)組的HGF及c-Met蛋白表達(dá)高于AMI對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Figure 5. Immunohistochemical staining of HGF (A1, B1 and C1) and c-Met (A2, B2 and C2) in the myocardial tissue (×200). A1, A2: sham; B1, B2: AMI; C1, C2: AMI+atorvastatin. Mean±SD. *P<0.05 vs sham; #P<0.05 vs AMI.

討 論

糖尿病AMI后心功能惡化會(huì)進(jìn)一步加劇，B?cklund等[8]研究顯示，糖尿病促進(jìn)了AMI后心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子高度表達(dá)等，以致加重AMI后的心臟重構(gòu)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：糖尿病大鼠AMI阿托伐他汀治療2周后，與對(duì)照組比較，阿托伐他汀干預(yù)組心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡、心臟重構(gòu)及心功能均顯著改善(P<0.05)。提示阿托伐他汀可顯著改善糖尿病AMI后心肌細(xì)胞凋亡、心臟重構(gòu)及心功能，也進(jìn)一步說(shuō)明他汀類藥物不單純是一種調(diào)脂藥，應(yīng)為更全面的 “心血管領(lǐng)域用藥”。既往有研究報(bào)道，他汀類藥物可能會(huì)誘發(fā)甚至加重糖尿病[9]，但結(jié)合實(shí)驗(yàn)及臨床綜合分析，他汀類藥物的利仍遠(yuǎn)大于弊，在心血管領(lǐng)域應(yīng)廣泛推廣。

他汀類藥物抑制AMI后心室重構(gòu)的機(jī)制目前仍不明確。既往研究發(fā)現(xiàn)HGF不僅存在肝臟，在心臟、腎臟、腦等組織均有一定表達(dá)，且對(duì)心臟及腎臟均具有重要的保護(hù)作用。HGF實(shí)際是間質(zhì)細(xì)胞衍生的一種能促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的多功能因子，是由α鏈和β鏈組成的異二聚體；其受體為原癌基因c-Met，α鏈先與c-Met結(jié)合，繼而β鏈與之結(jié)合，并誘導(dǎo)c-Met受體酪氨酸磷酸化，從而發(fā)揮其生物學(xué)活性[10]。

Guo等[11]通過(guò)研究AMI大鼠的治療，發(fā)現(xiàn)HGF能通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管再生，明顯改善心室重構(gòu)和心臟功能。Komamura等[12]在高血壓病大鼠治療中，發(fā)現(xiàn)HGF可改善高血壓及相應(yīng)的動(dòng)脈硬化和心力衰竭。實(shí)際，HGF信號(hào)通路在心血管藥物的作用機(jī)制中也扮演著重要的作用[13]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，AMI病人血液中HGF水平會(huì)升高，且與心室重構(gòu)及心功能具有相關(guān)性，其值越高表示預(yù)后越差[14]；同時(shí)也是AMI后最早的心肌損傷標(biāo)志物之一?？梢?jiàn)HGF/c-Met信號(hào)通路已成為心臟的一種重要保護(hù)機(jī)制，然而他汀類藥物對(duì)AMI后心臟重構(gòu)的影響是否與HGF/c-Met通路有關(guān)，目前仍未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1) AMI對(duì)照組HGF及c-Met的mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，提示HGF/c-Met信號(hào)通路在AMI后顯著激活；(2)阿托伐他汀干預(yù)組HGF及c-Met的mRNA及蛋白表達(dá)較AMI對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.05)，提示阿托伐他汀可通過(guò)增強(qiáng)HGF/c-Met通路，以改善AMI后心功能，發(fā)揮其AMI后心臟保護(hù)作用。

本研究為AMI后心力衰竭的研究擴(kuò)展思路，可考慮采用HGF基因治療。目前，已有一些探索，在AMI細(xì)胞移植治療中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HGF的移植細(xì)胞能更佳地改善AMI后心臟重構(gòu)及心功能[15]。Yuan等[16]采用微型氣泡運(yùn)載HGF治療AMI，發(fā)現(xiàn)可降低左室重量、心肌膠原含量及增加毛細(xì)血管密度。既往研究[17]發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈硬化性腎血管性疾病中，辛伐他汀可通過(guò)增加腎臟中HGF表達(dá)，抑制腎纖維化改善腎功能；Cantoni等[18]發(fā)現(xiàn)人間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)瑞舒伐他汀干預(yù)后， HGF及其受體表達(dá)增加；可見(jiàn)以上研究與本研究結(jié)果具有一定的一致性。體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)他汀可降低小鼠骨肉瘤細(xì)胞的HGF分泌[19]，說(shuō)明他汀類藥物對(duì)不同組織細(xì)胞在不同病理狀態(tài)下HGF表達(dá)的影響不完全一致。

他汀類藥物影響HGF通路的機(jī)制尚不明確。研究顯示血管緊張素II(angiotensin II, Ang II)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor, TGF)是HGF產(chǎn)生的重要抑制劑[20]，心力衰竭及AMI后Ang II及TGF表達(dá)會(huì)明顯增加，在一定程度上會(huì)對(duì)HGF產(chǎn)生起下調(diào)作用；有研究[21]已報(bào)道他汀類藥物可明顯抑制AMI后Ang II及TGF的增加，進(jìn)而促進(jìn)HGF表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)。當(dāng)然他汀影響HGF通路的具體機(jī)制究竟如何，可能仍需進(jìn)一步研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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