嚴廣東， 李自成， 李健豪， 張在勇， 趙善雋， 張穩(wěn)柱△

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心內(nèi)科, 廣東 廣州 511400;2暨南大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科, 廣東 廣州 510630)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)及繼發(fā)的心力衰竭嚴重威脅著人們的生活質(zhì)量和生命健康，尤其是伴有糖尿病者。糖尿病(diabetes mellitus, DM)人群中急性心肌梗死及繼發(fā)心力衰竭、猝死的發(fā)生率明顯增加，其AMI預后明顯不及非糖尿病者[1-2]。研究表明，AMI后心功能的惡化主要與心肌纖維化、心肌細胞凋亡等所致的心室重構(gòu)有關(guān)，且心肌細胞凋亡與心室重構(gòu)間可相互加重[3]。他汀類藥物是指南強烈推薦的調(diào)脂藥，其不僅具有調(diào)脂作用，還具有抑制炎癥反應和氧化應激、改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊等多種獨立于調(diào)脂作用外的“多效性”[4-5]。近年來，有臨床研究及動物實驗顯示，他汀類藥物可以抑制AMI后心室重構(gòu)及心功能惡化[6]，而以往研究大多針對于非糖尿病，目前涉及糖尿病AMI后心肌細胞凋亡、心室重構(gòu)及心功能能否從他汀干預中獲益的研究較少。其實，他汀類藥物改善心功能的具體機制尚不明確，肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)通路是影響心肌纖維化、細胞凋亡及心室重構(gòu)關(guān)鍵的信號通路之一。既往研究顯示，HGF不僅表達于肝臟，其在心臟、腎臟均有表達，可通過作用其心臟上的受體c-Met，發(fā)揮抗炎、抗心肌纖維化、抗心肌細胞凋亡及促血管再生等作用，改善心室重構(gòu)及心功能[7]。然而，他汀類藥物對AMI后心室重構(gòu)及心功能的影響是否與HGF/c-Met信號通路有關(guān)，既往未見報道。本研究將觀察他汀類藥物對糖尿病大鼠AMI后心肌細胞凋亡、心室重構(gòu)及心功能的影響，并探討其作用是否與 HGF/c-Met信號通路有關(guān)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動物 清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(8周齡，體重200～250 g)70只，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供,許可證號為SCXK(粵)2008-0002。

1.2主要試劑與儀器 鏈脲霉素(streptozotocin，STZ)購自上海寶曼生物科技有限公司；末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP切口末端標記法(TUNEL)試劑盒購自Roche；抗HGF多克隆抗體、抗c-Met多克隆抗體購自SAB；HGF及c-Met實時熒光定量PCR(real-time PCR)逆轉(zhuǎn)錄引物購自上海GenePharm公司，cDNA試劑盒購自Fermentas；Philip公司ATL-HDI5000多普勒心臟彩超儀。

2 方法

2.1建立鏈脲霉素誘導的糖尿病大鼠模型 采用一次性腹腔內(nèi)注射STZ法(65 mg/kg，溶于0.1 mmol/L、pH 4.5的檸檬酸鈉緩沖液)制備1型糖尿病大鼠模型。于STZ注射后3 d、7 d、30 d和8周時，用便攜式血糖儀(拜耳公司)檢測血糖。血糖≥16.7 mmol/L，具有多尿、多飲、多食、消瘦及毛色灰暗的大鼠入選本研究。血糖不達標，即<16.7 mmol/L的大鼠從本研究中剔除。

2.2急性心肌梗死大鼠模型的建立及分組 誘導糖尿病后8周時，對糖尿病大鼠構(gòu)建急性心肌梗死模型。假手術(shù)組11只僅在相應左冠狀動脈部位處穿線但不結(jié)扎。AMI術(shù)后存活32只大鼠隨機分為2組：AMI對照組(n=16)和阿托伐他汀干預組(n=16, 20 mg·kg-1·d-1)。于術(shù)后24 h始，阿托伐他汀干預組予以相應劑量阿托伐他汀(立普妥，輝瑞公司)溶于3 mL生理鹽水中灌胃，AMI對照組和假手術(shù)組均予以等量生理鹽水灌胃，治療時間共計2周。

2.3心臟彩超檢測 治療2周后，大鼠經(jīng)10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，采用ATL-HDI5000多普勒心臟彩超儀(10 MHz探頭)測定左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左室長軸縮短分數(shù)(fractional shortening, FS)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter, LVDd)和左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter, LVDs),取5個連續(xù)心動周期的平均值。

2.4血脂的檢測 心臟彩超檢測完成后，即刻對麻醉大鼠開胸，暴露心臟經(jīng)心室取血3 mL，分離血清(KDC-160HR離心機，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min),使用全自動生化分析儀檢測甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)。

2.5心肌組織標本采集 采血完成后，取出心臟去除心房，沿心臟長軸將左心室分為兩部分，靠近心尖一側(cè)心肌制作病理切片，用于形態(tài)學檢測(HE染色和Masson染色)、心肌細胞凋亡檢測及免疫組化檢測；余下部分去除梗死區(qū)域后置于-80 ℃液氮中，用于real-time PCR檢測。

2.6病理切片分析

2.6.1HE染色和Masson染色 (1)HE染色：觀察糖尿病大鼠心肌梗死后心肌組織病理學改變；(2)Masson染色：可將膠原纖維染成藍色、心肌纖維染成紅色，在光學顯微鏡下(×100)隨機選取5個梗死周邊區(qū)視野進行觀察，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析，測定心肌膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction, CVF)，即膠原面積/(膠原面積+心肌面積)。

2.6.2心肌細胞凋亡的檢測 采用TUNEL標記法標記心肌細胞凋亡，光鏡下觀察正常細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈深淺不一的顆粒狀棕黃色，即為陽性反應。凋亡細胞的半定量分析：在400倍光鏡下，每張切片計數(shù)5個視野中陽性細胞核數(shù)/總細胞核數(shù)，取其平均值作為心肌細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index)。

2.6.3免疫組化檢測心肌組織中HGF和c-Met蛋白的表達 抗HGF多克隆抗體稀釋度為1∶100，抗c-Met多克隆抗體稀釋度為1∶150,陽性產(chǎn)物為棕黃色。應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，隨機選取5個視野(×200)以求出積分吸光度值(integral absorbance,IA)，各組間的蛋白表達采用IA值進行統(tǒng)計。

2.7Real-time PCR檢測心肌組織中HGF和c-Met mRNA的表達 采用Trizol法提取心肌組織中的總RNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內(nèi)參照。HGF上游引物5′-GAGAGAGGCGAGGAGAAACG-3′，下游引物5′-GTGTAGCCCCAGCCGTAAAT-3′；c-Met上游引物5′-ACGTACGGTGTCTCCAGCAT-3′，下游引物5′-CTGGAGACACAGGATAGGAA-3′；GAPDH上游引物5′-CTCAGTTGCTGAGGAGTCCC-3′，下游引物5′-ATTCGAGAGAAGGGAGGGCT-3′。合成cDNA后，在R1011122 Rotor-Gene 熒光定量PCR儀上進行實時定量PCR。反應結(jié)束后，以目的基因的拷貝數(shù)/內(nèi)參照的拷貝數(shù)為各基因的相對表達量進行統(tǒng)計。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，利用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計。組間差異采用單因素方差分析，方差齊時組間多重比較用LSD檢驗，方差不齊時用Dunnett’s T3檢驗分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

AMI后2周，各組存活大鼠：假手術(shù)組9只，AMI對照組10只，阿托伐他汀干預組12只。存活大鼠進行心臟彩超、組織學、HGF和c-Met mRNA及蛋白檢測。

1 各組大鼠心功能的比較

大鼠心臟彩超檢測，AMI對照組及阿托伐他汀干預組大鼠LVEF和FS明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，LVDd和LVDs明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，說明實驗AMI模型構(gòu)建成功；阿托伐他汀干預組大鼠LVEF和FS高于AMI對照組，LVDd和LVDs低于AMI對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1、表1。

Figure 1. Echocardiography of rats from different groups. A: sham; B: AMI; C: AMI+atorvastatin.

表1 各組大鼠心臟彩超檢測參數(shù)的比較

2 各組大鼠血糖、血脂的比較

2周后3組糖尿病大鼠體重、血糖及血脂水平變化如表2所示，各組間體重、血糖及各項血脂水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 心肌組織病理學改變

HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細胞排列規(guī)則，走向好，無肌絲斷裂，細胞間隙均勻，少量炎癥細胞浸潤；AMI對照組具有明顯較大面積的梗死區(qū)，心肌細胞顯著減少、肌絲斷裂、結(jié)構(gòu)紊亂，有大量炎癥細胞浸潤；阿托伐他汀干預組與AMI對照組比較，其心肌細胞變性減少、結(jié)構(gòu)紊亂減輕及炎癥細胞浸潤明顯減少，見圖2。

表2 各組大鼠體重、血糖、血脂水平的比較

Masson染色結(jié)果顯示，AMI對照組及阿托伐他汀干預組發(fā)生心肌纖維化程度均較假手術(shù)組明顯，但阿托伐他汀干預組的心肌纖維化的程度較AMI對照組明顯減輕(P<0.05)，見圖2。各組的CVF值見圖2。

4 心肌細胞的凋亡

TUNEL檢測結(jié)果顯示，假手術(shù)組見少量心肌細胞凋亡，AMI對照組和阿托伐他汀干預組心肌細胞凋亡均較假手術(shù)組明顯，他汀干預組心肌細胞凋亡較AMI對照組明顯減輕(P<0.05)，TUNEL染色圖及各組心肌細胞凋亡指數(shù)見圖3。

Figure 3. TUNEL staining (×400) of the myocardial tissue (the upper figure) and comparison of myocardial apoptotic index among the 3 groups (the lower fi-gure). A: sham; B: AMI; C: AMI+atorvastatin. Mean±SD. *P<0.05 vs sham; #P<0.05 vs AMI.

5 心肌組織中HGF及c-Met mRNA表達的比較

采用real-time PCR檢測心肌組織中HGF及c-Met mRNA表達情況，結(jié)果顯示，AMI對照組及阿托伐他汀干預組均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05), 阿托伐他汀干預組的HGF及c-Met mRNA表達高于AMI對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. Comparison of HGF and c-Met mRNA among the 3 groups. Mean±SD. *P<0.05 vs sham; #P<0.05 vs AMI.

6 心肌組織中HGF及c-Met蛋白表達的比較

免疫組化檢測心肌組織中HGF及c-Met蛋白表達情況如圖5所示，AMI對照組及阿托伐他汀干預組均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05), 阿托伐他汀干預組的HGF及c-Met蛋白表達高于AMI對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Figure 5. Immunohistochemical staining of HGF (A1, B1 and C1) and c-Met (A2, B2 and C2) in the myocardial tissue (×200). A1, A2: sham; B1, B2: AMI; C1, C2: AMI+atorvastatin. Mean±SD. *P<0.05 vs sham; #P<0.05 vs AMI.

討 論

糖尿病AMI后心功能惡化會進一步加劇，B?cklund等[8]研究顯示，糖尿病促進了AMI后心肌細胞凋亡、心肌纖維化及結(jié)締組織生長因子高度表達等，以致加重AMI后的心臟重構(gòu)。我們的實驗結(jié)果顯示：糖尿病大鼠AMI阿托伐他汀治療2周后，與對照組比較，阿托伐他汀干預組心肌纖維化、心肌細胞凋亡、心臟重構(gòu)及心功能均顯著改善(P<0.05)。提示阿托伐他汀可顯著改善糖尿病AMI后心肌細胞凋亡、心臟重構(gòu)及心功能，也進一步說明他汀類藥物不單純是一種調(diào)脂藥，應為更全面的 “心血管領域用藥”。既往有研究報道，他汀類藥物可能會誘發(fā)甚至加重糖尿病[9]，但結(jié)合實驗及臨床綜合分析，他汀類藥物的利仍遠大于弊，在心血管領域應廣泛推廣。

他汀類藥物抑制AMI后心室重構(gòu)的機制目前仍不明確。既往研究發(fā)現(xiàn)HGF不僅存在肝臟，在心臟、腎臟、腦等組織均有一定表達，且對心臟及腎臟均具有重要的保護作用。HGF實際是間質(zhì)細胞衍生的一種能促進細胞有絲分裂的多功能因子，是由α鏈和β鏈組成的異二聚體；其受體為原癌基因c-Met，α鏈先與c-Met結(jié)合，繼而β鏈與之結(jié)合，并誘導c-Met受體酪氨酸磷酸化，從而發(fā)揮其生物學活性[10]。

Guo等[11]通過研究AMI大鼠的治療，發(fā)現(xiàn)HGF能通過抑制心肌細胞凋亡和促進血管再生，明顯改善心室重構(gòu)和心臟功能。Komamura等[12]在高血壓病大鼠治療中，發(fā)現(xiàn)HGF可改善高血壓及相應的動脈硬化和心力衰竭。實際，HGF信號通路在心血管藥物的作用機制中也扮演著重要的作用[13]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，AMI病人血液中HGF水平會升高，且與心室重構(gòu)及心功能具有相關(guān)性，其值越高表示預后越差[14]；同時也是AMI后最早的心肌損傷標志物之一?？梢奌GF/c-Met信號通路已成為心臟的一種重要保護機制，然而他汀類藥物對AMI后心臟重構(gòu)的影響是否與HGF/c-Met通路有關(guān)，目前仍未見相關(guān)報道。本實驗結(jié)果顯示：(1) AMI對照組HGF及c-Met的mRNA及蛋白表達顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，提示HGF/c-Met信號通路在AMI后顯著激活；(2)阿托伐他汀干預組HGF及c-Met的mRNA及蛋白表達較AMI對照組顯著上調(diào)(P<0.05)，提示阿托伐他汀可通過增強HGF/c-Met通路，以改善AMI后心功能，發(fā)揮其AMI后心臟保護作用。

本研究為AMI后心力衰竭的研究擴展思路，可考慮采用HGF基因治療。目前，已有一些探索，在AMI細胞移植治療中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HGF的移植細胞能更佳地改善AMI后心臟重構(gòu)及心功能[15]。Yuan等[16]采用微型氣泡運載HGF治療AMI，發(fā)現(xiàn)可降低左室重量、心肌膠原含量及增加毛細血管密度。既往研究[17]發(fā)現(xiàn)，在動脈硬化性腎血管性疾病中，辛伐他汀可通過增加腎臟中HGF表達，抑制腎纖維化改善腎功能；Cantoni等[18]發(fā)現(xiàn)人間充質(zhì)干細胞經(jīng)瑞舒伐他汀干預后， HGF及其受體表達增加；可見以上研究與本研究結(jié)果具有一定的一致性。體外細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)他汀可降低小鼠骨肉瘤細胞的HGF分泌[19]，說明他汀類藥物對不同組織細胞在不同病理狀態(tài)下HGF表達的影響不完全一致。

他汀類藥物影響HGF通路的機制尚不明確。研究顯示血管緊張素II(angiotensin II, Ang II)和轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)是HGF產(chǎn)生的重要抑制劑[20]，心力衰竭及AMI后Ang II及TGF表達會明顯增加，在一定程度上會對HGF產(chǎn)生起下調(diào)作用；有研究[21]已報道他汀類藥物可明顯抑制AMI后Ang II及TGF的增加，進而促進HGF表達進一步上調(diào)。當然他汀影響HGF通路的具體機制究竟如何，可能仍需進一步研究。

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