鄭朝攀, 韓 靈, 侯偉堅, 文譯輝, 傅 然, 文衛(wèi)平

(中山大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科醫(yī)院，中山大學耳鼻咽喉科學研究所，廣東 廣州 510080)

鼻咽癌是我國華南地區(qū)高發(fā)病率惡性腫瘤；雖然早期鼻咽癌放射治療效果良好，但鼻咽癌的復發(fā)、轉移以及對放化療抵抗等問題降低了生存率[1]。既往研究中，miR-9參與了多種腫瘤的惡性生物過程和惡性特質[2]。我們也在鼻咽癌的相關研究中發(fā)現(xiàn)負向調控miR-9能夠促進腫瘤細胞對紫外線介導的活性氧損傷[3]；但是和鼻咽癌預后密切相關的增殖和轉移等相關研究有待完善。本實驗通過轉染miR-9抑制劑下調鼻咽癌腫瘤細胞中miR-9表達，觀察了腫瘤增殖、遷移以及侵襲的變化，并初步探討其相關作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人鼻咽癌細胞系CNE2(低分化腫瘤細胞)和CNE1(高分化腫瘤細胞)為研究對象。腫瘤細胞通過應用LipofectamineTM2000進行轉染處理，并按照miR-9抑制組和miR-9抑制對照組進行分組。miR-9抑制劑與抑制對照劑均由上海吉瑪公司合成。LipofectamineTM2000 (Invitrogen)。miR-9抑制劑序列為5’- ucauacagcuagauaaccaaaga-3’；抑制對照劑序列為5’- caguacuuuuguguaguacaa -3’。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone)；CCK-8 檢測試劑(同仁生物化工有限公司)；PI周期試劑盒(凱基生物有限公司)；Transwell侵襲小室(Corning)。上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和GAPDH抗體分別為Boster和Santa Cruze產(chǎn)品。其它試劑為國產(chǎn)試劑。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)和轉染 細胞均置于37 ℃含5%CO2濕飽和的培養(yǎng)箱中，應用10%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；當細胞濃度達到70%～80%時給予消化傳代。在細胞進行轉染過程中，當細胞密度達到30%～50%時，應用脂質體LipofectamineTM2000進行轉染，分為抑制組和對照組(按照使用說明，轉染濃度為25 nmol/L進行轉染)。轉染后4 h后更換新培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)以用于后續(xù)實驗。

2.2CCK-8檢測細胞增殖 腫瘤細胞轉染4 h后，重懸細胞。取96孔板，設6個復孔，調整每孔細胞的濃度為1×108cells/L，連續(xù)培養(yǎng)72 h；分別在轉染培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，更換培養(yǎng)液，每孔10 μL CCK-8 與 90 μL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液；培養(yǎng)箱內孵育 1 h，用多功能酶標儀測定在 450 nm波長的吸光度(A)。

2.3流式細胞術檢測細胞周期 腫瘤細胞轉染48 h后，收集轉染腫瘤細胞，70%乙醇固定1 h，RNA酶消化0.5 h后給予碘化丙啶染色，流式細胞術檢測細胞周期變化。

2.4細胞劃痕實驗和侵襲實驗 劃痕實驗為在腫瘤細胞轉染48 h、培養(yǎng)細胞單層長滿達90%后，10 μL槍頭劃線，更換無血清RPMI-1640培養(yǎng)液孵育24 h，并分別在0 h、24 h觀察照相；然后根據(jù)劃痕間垂直直線距離，隨機取10組數(shù)據(jù)，進行分析。侵襲實驗用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞，接種于martrigel包被的Transwell小室內，外槽加入含5%血清培養(yǎng)基。12 h后，棉簽蘸去上層的細胞，用DAPI染核；熒光顯微鏡檢測細胞，隨機選取10×20鏡下5個視野，并計數(shù)。

2.5免疫印跡實驗和免疫熒光實驗 腫瘤細胞轉染48 h后，提取總蛋白；常規(guī)電泳，半干轉膜，封閉，給予E-cadherin、β-catenin和GAPDH抗體4 ℃孵育過夜，加入對應的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗常溫孵育1 h后，滴加ECL發(fā)光液，膠片顯影，定影。ImageJ軟件分析各蛋白條帶的灰度值。以GAPDH蛋白表達為內參照，以目的蛋白和GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對含量，進行分析。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 負向調控miR-9抑制鼻咽癌細胞的增殖

CNE1細胞轉染72 h后， 轉染抑制組與對照組細胞比較，A值存在顯著差異(P<0.05)；而CNE2細胞在轉染48 h和72 h后2組均存在A值顯著差異(P<0.01；P<0.05)，見圖1。結果表明負向調控miR-9表達抑制了不同分化鼻咽癌細胞的增殖。

Figure 1. Changes of cell proliferation were tested with CCK-8 after miR-9 expression was inhibited.A: CNE2 cells; B: CNE1 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control.

2 負向調控miR-9阻滯鼻咽癌細胞在G0/G1期分布

經(jīng)PI染色法流式細胞術檢測，在鼻咽癌CNE2細胞轉染48 h后，miR-9抑制組中G0/G1期細胞比例為(57.96±1.39)%，比對照組細胞[(47.93±1.76)%]明顯增加(P<0.05)；而S期和G2期細胞比例[S期: (31.27±3.56)%；G2期: (20.79±3.85)%]與對照組[S期: (32.72±1.17)%；G2期: (16.70±4.19)%]無顯著差異。CNE1細胞中，miR-9抑制組腫瘤細胞中處于G0/G1期的細胞數(shù)較對照組亦增多[(51.24±0.88)%vs(48.29±0.39)%，P<0.05]，S期和G2期細胞比例與對照組比較無顯著差異，見圖2。抑制不同分化鼻咽癌細胞miR-9表達，可阻滯腫瘤細胞于G0/G1期，抑制了腫瘤細胞的增殖。

Figure 2. Changes of cell cycle after miR-9 expression was inhibited.Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs CNE2-control;#P<0.05 vs CNE1-control.

3 負向調控miR-9對鼻咽癌細胞遷移和侵襲作用

劃痕實驗提示，抑制鼻咽癌細胞miR-9表達后，miR-9抑制組較對照組遷移距離明顯縮短。CNE2細胞：抑制組細胞遷移距離為(186.50±7.94)μm,對照組為(247.56±15.56)μm, 差異顯著(P<0.05)；CNE1細胞：抑制組和對照組分別為(139.06±16.73)μm和(230.66±14.27)μm, 差異顯著(P<0.01)；見圖3A。Transwell侵襲實驗中， CNE2細胞抑制miR-9表達組較對照組降解基質和侵襲的細胞數(shù)明顯減少(43.00±3.17vs65.80±5.20,P<0.01)；而CNE1細胞抑制miR-9表達后，雖然抑制組較對照組侵襲細胞數(shù)降低，但兩者無明顯差異(54.60±2.60vs63.00±3.53,P>0.05),見圖3B。

4 負向調控miR-9對β-catenin和E-cadherin表達的影響

免疫印跡實驗表明抑制CNE2細胞miR-9表達后， E-cadherin水平增加，并伴有β-catenin含量降低；CNE1細胞抑制組E-cadherin水平與對照組比無明顯差異，但β-catenin水平降低，差異顯著，見圖4。

Figure 3. Changes of the abilities of migration (A) and invasion (B) after miR-9 expression was inhibited. Mean±SD. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs control.

Figure 4. Changes of the expression of β-catenin and E-cadherin after miR-9 expression was inhibited.A: expression of β-catenin and E-cadherin in CNE2 cells; B: expression of β-catenin and E-cadherin in CNE1 cells; C:relative intensity of expression of β-catenin and E-cadherin in different cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control.

討 論

通過研究miRNA相關機制揭示腫瘤惡性生物特征以及各種治療抵抗等是研究腫瘤的熱點；在鼻咽癌細胞中，通過觀察腫瘤細胞放療后miRNA的差異表達可以作為研究鼻咽癌放療抵抗的切入點[3-4]。miR-9在不同的腫瘤細胞中異常表達決定了其和腫瘤關系密切。在霍奇金淋巴瘤、乳腺癌細胞、神經(jīng)源性腫瘤等細胞中，miR-9促進腫瘤增殖；但在卵巢癌、黑色素瘤等腫瘤細胞中，miR-9則抑制了細胞的增殖和轉移[2,5-6]。雖然我們既往發(fā)現(xiàn)miR-9能夠調節(jié)鼻咽癌細胞對紫外線介導的活性氧損傷，但是其對增殖和轉移等相關研究有待深入。

在鼻咽癌的相關研究中，Wang等[7]和Song等[8]指出β-catenin可以作為鼻咽癌細胞治療與預后的一個重要指標。miR-200a、let-7和miR-26等均可通過不同的作用靶基因發(fā)揮調節(jié)鼻咽癌細胞增殖的作用[9-11]。Xia等[10]在miR-200a研究中指出，miR-200a對CNE1細胞增殖的抑制作用主要通過對β-catenin的抑制而發(fā)揮作用，但是在C666細胞中卻發(fā)揮截然相反的作用。Lu等[9]則通過過表達miR-26延長G1期細胞比例，抑制了腫瘤細胞的增殖與克隆形成。本實驗中，抑制miR-9表達后，不同分化程度的鼻咽癌細胞均阻滯腫瘤細胞于G0/G1期，并抑制了腫瘤細胞增殖。雖然負向調控miR-9后β-catenin表達變化機制未能明確，miR-9調節(jié)E-cadherin表達后相關上皮-間質轉化過程以及β-catenin的相應變化可能是重要因素[12]。結果表明抑制miR-9表達后，鼻咽癌細胞中β-catenin水平顯著降低其與抑制腫瘤細胞的增殖變化密切相關。

鼻咽癌侵襲和遠處轉移是影響預后的重要因素。作為重要的黏附蛋白，E-cadherin與多種腫瘤的轉移、放療以及預后關系密切[13-14]；同時通過抑制其表達可促進鼻咽癌細胞的侵襲和轉移能力[15]。鼻咽癌細胞中，miR-200a通過調控E-cadherin的轉錄抑制因子鋅指E盒結合同源盒蛋白2(zinc-finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)，促進了腫瘤細胞侵襲和遷移[10]。Ma等[12]指出miR-9直接抑制E-cadherin表達明顯促進腫瘤細胞的轉移和侵襲能力。實驗中，CNE2細胞中抑制miR-9表達促進E-cadherin含量增加，而CNE1細胞中E-cadherin表達變化對于miR-9負向調控后無明顯變化；因此對應的腫瘤細胞中侵襲細胞數(shù)出現(xiàn)變化，但遷移能力均明顯受到抑制。實驗結果表明，E-cadherin的變化是miR-9調節(jié)鼻咽癌腫瘤細胞侵襲和遷移能力的關鍵蛋白。

本實驗通過負向調控鼻咽癌細胞中miR-9表達抑制了腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，提示miR-9可能與鼻咽癌細胞的增殖、惡性轉化和預后密切相關。結合miR-9對于放療相關的活性氧的調節(jié)作用，miR-9可能作為鼻咽癌治療研究的新靶點，需要我們進一步關注和深入。

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