鞏 波， 李東風(fēng)， 謝子鈞， 段伊帆， 李子俊△

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515；廣東省人民醫(yī)院， 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 2消化科， 3醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510080)

在美國和大部分歐洲國家，結(jié)直腸癌是第3位常見的惡性腫瘤，與腫瘤相關(guān)的死亡原因排第2位，在這些病人中，大約有20%的病人在獲得臨床診斷時已發(fā)生轉(zhuǎn)移[1]。西妥昔單抗靶向表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)，抑制細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移，已被美國FDA批準用于KRAS野生型結(jié)直腸癌的治療[2]。但是并非所有KRAS野生型結(jié)直腸癌都能從西妥昔單抗治療中獲益，據(jù)報道在占結(jié)直腸癌60%～70% 的KRAS野生型中，只有其中60%獲得治療反應(yīng)，余下40% KRAS野生型結(jié)直腸癌治療無效或耐藥[3]。而迄今研究表明miR-21在人體31種腫瘤中表達異常，也是最常見的異常microRNA之一，是一種致癌性microRNA， 在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。本實驗通過體外實驗上調(diào)/下調(diào)miR-21，探討其對人結(jié)腸癌細胞RKO的增殖、克隆形成能力及對西妥昔單抗敏感性的影響，為下一步體內(nèi)實驗和臨床研究提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細胞

人結(jié)腸癌細胞株RKO(購自中國科學(xué)院上海細胞研究所)使用MEM Alpha培養(yǎng)基(Life Technologies)加10%胎牛血清(Life Technologies)，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)。

2 方法

2.1慢病毒載體的構(gòu)建 根據(jù)人miR-21的基因序列，制備上調(diào)/下調(diào)miR-21雙鏈DNA Oligo，設(shè)計包含目的基因序列和酶切位點的互補序列，LV-miR-21上游引物5’-CGGCCGCGACTCTAGTTATCAAATCCTGCCTGACTG-3’，下游引物5’- ATAAGCTTGATATCG-TCCTCCCTCCATACTGCTG-3’；LV-anti-miR-21上游引物5’-CCGGTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTG-3’，下游引物5’-AATTCAAAAATAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’。將引物退火形成帶黏性末端的雙鏈DNA，利用T4 DNA ligase分別連接到GV217和GV159載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，挑選轉(zhuǎn)化的菌落，用菌落PCR進行鑒定和測序。

2.2慢病毒載體的包裝 取生長狀態(tài)良好的293T細胞消化重懸后按1∶5比例傳至poly-(D-lysine)(PDL)包被的10 cm皿中，加完全培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)約24 h，細胞密度達50%～70%時即可用于轉(zhuǎn)染。取1.5 mL/dish Opti-MEM、表達質(zhì)粒6 μg/dish、包裝質(zhì)粒Packaging Mix 6 μg/dish，混勻，室溫下溫育5 min；取1.5 mL/dish Opti-MEM和POLOdeli-vererTM3000 Transfection reagent 24 μL/dish，輕輕混勻，室溫下溫育5 min。將兩者混合，室溫下孵育20 min。將DNA與POLOdelivererTM3000 Transfection reagent 的復(fù)合液均勻地滴加在293T細胞的培養(yǎng)液中混勻，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，收集293T細胞上清液，4 ℃暫存；細胞更換新鮮完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，收集病毒上清，與第1次收集的混合，于 4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，用0.45 μm 醋酸纖維素膜的濾器過濾于Beckman SW28離心管中，每管裝36 mL病毒，4 ℃、22 000 r/min 離心2 h，棄上清，每管用130 μL預(yù)冷的PBS溶解沉淀，每管100 μL分裝，-80 ℃保存。

2.3慢病毒滴度測定 測定前1 d，取測定滴度所需的293T細胞，每孔加100 μL，4×104個細胞接種到96孔板，根據(jù)病毒的預(yù)期滴度，準備7～10個無菌的EP 管，在每個管中加入 90 μL 的無血清培養(yǎng)基，將待測定的病毒原液 10 μL 加入到第1個管中，混勻后，取 10 μL 加入到第2個管中，繼續(xù)相同的操作直到最后1管。選取所需的細胞孔，吸去 90 μL 培養(yǎng)基，丟棄，加入 90 μL 稀釋好的病毒溶液，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后，加入完全培養(yǎng)基 100 μL。4 d 后，觀察熒光表達情況。病毒滴度=陽性細胞數(shù)×計量孔稀釋倍數(shù)/接種病毒體積。

2.4細胞感染 取生長狀態(tài)良好的RKO細胞，胰酶消化后用全培養(yǎng)基重懸細胞，每孔2×105個細胞接種到6孔板，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)約24 h。取6孔板中的一孔細胞進行消化，計數(shù)細胞，根據(jù)MOI和細胞數(shù)量計算所需要的病毒量稀釋到培養(yǎng)基中；吸去舊培養(yǎng)基，加入含病毒液的培養(yǎng)基，同時設(shè)置陰性對照空載體組和空白對照組，12 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，初步估計慢病毒感染效率。

2.5qRT-PCR檢測miR-21的表達 收集上調(diào)/下調(diào)miR-21、陰性對照及空白對照的RKO細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA并測定總RNA的濃度及純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo)合成cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，4 ℃終止。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，用Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)試劑盒(Toyobo)進行qRT-PCR檢測，以U6為內(nèi)參照，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s， 然后95 ℃ 10 s， 60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45個循環(huán)，每個樣品設(shè)置4個復(fù)孔。采用Lightcycle羅式熒光定量PCR儀進行檢測。采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行分析。

2.6細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期的上調(diào)/下調(diào)miR-21、陰性對照及空白對照的RKO細胞，胰酶消化，細胞計數(shù)后按照每孔1×104個細胞接種到96孔板，每組設(shè)置6個復(fù)孔，與實驗孔平行設(shè)不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔，分別接種4塊板，于培養(yǎng)后24 h、48 h、72 h和96 h分別加入MTT溶液(5 g/L)20 μL/well，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；于490 nm波長處測定A值。

2.7克隆形成實驗 配置1.2%和0.7%無菌低熔點瓊脂液體，40 ℃維持，使之保持溶解狀態(tài)。按1∶1混合1.2%瓊脂糖和2×完全培養(yǎng)基，按每孔取2 mL混合液注入6孔板中，待冷卻凝固，備用。收集對數(shù)生長期的上調(diào)/下調(diào)miR-21、陰性對照及空白對照的RKO細胞，制成1×107/L的細胞懸液；按1∶1比例將0.7%瓊脂和2×完全培養(yǎng)基在無菌試管中混合后，取1 mL混合液+0.1 mL單細胞懸液(1×103cells/well)，充分混勻、注入已鋪有底層瓊脂的培養(yǎng)板中，在室溫放置20 min使細胞瓊脂懸液凝固。將6孔板置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃進行培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d，觀察細胞克隆形成情況并計數(shù)。

2.8凋亡實驗 胰酶消化上調(diào)/下調(diào)miR-21、陰性對照及空白對照的RKO細胞，分別收集(1～5)×105細胞。在50 μL binding buffer中加入5 μL 7-AAD染液，混勻；收集細胞中加入上述7-AAD染液，混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min；再加入450 μL binding buffer混勻后加入1 μL Annexin V-PE混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min；1 h內(nèi)流式細胞術(shù)檢測。

2.9西妥昔單抗敏感性檢測 取對數(shù)生長期的上調(diào)/下調(diào)miR-21、陰性對照及空白對照的RKO細胞，胰酶消化，細胞計數(shù)后按照每孔1×104個細胞接種到96孔板，24 h后，加入300 mg/L的西妥昔單抗，不同細胞設(shè)3復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基及10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)，每30 min在波長450 nm測定吸光度A值，直至未加藥孔的A值為1.0～1.2時為最佳時間。細胞抑制率=(實驗孔A值-空白孔A值)/(未加藥孔A值-空白孔A值)×100%。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 13.0 軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析或重復(fù)測量資料的方差分析比較轉(zhuǎn)染不同慢病毒的細胞間miR-21的表達、細胞增殖能力、克隆形成能力、細胞凋亡、藥物敏感性等的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 重組慢病毒的包裝與轉(zhuǎn)染

將構(gòu)建好的慢病毒干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細胞中，包裝產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，通過觀察綠色熒光，可見90%以上的細胞帶有綠色熒光,見圖1。收集濃縮病毒顆粒后測定LV-miR-21與LV-anti-miR-21的滴度分別為3.0×1012TU/L和2.0×1012TU/L，將病毒顆粒分別感染人結(jié)腸癌RKO細胞，觀察綠色熒光，感染效率在80%以上，見圖2。

Figure 1. 293T cells transfected with the lentivirus interference plasmids(×100). A,B: LV-miR-21; C,D: LV-anti-miR-21.A,C:fluorescence view; B,D: phase-contrast view.

Figure 2. RKO cells transfected with different lentiviral vectors(×100). A1, A2: LV-miR-21; B1, B2: LV-miR-21 NC; C1,C2: LV-anti-miR-21; D1, D2: LV-anti-miR-21 NC.A1,B1,C1,D1: fluorescence view; A2,B2,C2,D2: phase-contrast view.

2 qRT-PCR檢測結(jié)腸癌細胞RKO轉(zhuǎn)染慢病毒干擾載體后miR-21的表達

轉(zhuǎn)染LV-miR-21、LV-anti-miR-21、相應(yīng)陰性對照載體和空白組的miR-21相對表達量分別為9.45±0.56、0.55±0.13、1.17±0.10、1.11±0.09和1.00±0.00，其中LV-miR-21組的表達量高于其陰性對照組及空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；LV-anti-miR-21組的表達量低于其陰性對照組及空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而陰性對照組與空白組的表達量之間無明顯差異(P>0.05)，見圖3。

3 MTT檢測人結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)染不同慢病毒后細胞增殖能力的變化

MTT實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染LV-anti-miR-21后，隨著時間的增長，細胞的增殖能力明顯降低；轉(zhuǎn)染LV-miR-21后，隨著時間的增長，細胞的增殖能力明顯增強。在第2天、3天和4天，LV-miR-21組、LV-anti-miR-21組和空白組之間細胞增殖能力有明顯差異(P<0.01)，見圖4。

Figure 3. Expression of miR-21 in transfected RKO cells.Mean±SD.n=4. *P<0.05 vs LV-anti-miR-21, LV-miR-21 NC or control; #P<0.05 vs LV-miR-21 or LV-anti-miR-21 NC.

Figure 4. Proliferation of RKO cells with different treatments.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs LV-anti-miR-21.

4 轉(zhuǎn)染不同慢病毒后克隆形成能力的變化

LV-miR-21組的細胞克隆形成能力明顯高于其陰性對照組、空白組和LV-anti-miR-21組(P<0.01)；而LV-anti-miR-21組的細胞克隆形成能力低于其陰性對照組和空白組(P<0.01)，見圖5。

5 轉(zhuǎn)染不同慢病毒后細胞凋亡的變化

LV-anti-miR-21組的早期凋亡率明顯高于LV-miR-21組(P<0.01)，見圖6。這說明下調(diào)miR-21可以促進細胞的凋亡。

Figure 5. Colony-forming ability of the RKO cells with different treatments.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs LV-miR-21.

Figure 6. The early apoptotic rate of the RKO cells with different treatments.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs LV-anti-miR-21.

6 下調(diào)miR-21可增強腫瘤細胞對靶向治療藥物西妥昔單抗的敏感性

在300 mg/L西妥昔單抗作用下，LV-anti-miR-21組的細胞抑制率高于LV-miR-21組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

討 論

MicroRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，能夠調(diào)控mRNA的表達或翻譯, 在生物體的發(fā)育、增殖、分化及凋亡等方面發(fā)揮重要的生理作用[4]。近年來, 越來越多的研究表明, 許多micro-RNA可作為原癌基因或者抑癌基因, 在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色。目前發(fā)現(xiàn)，食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、膽管癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中miR-21的水平明顯上調(diào)。miR-21在眾多腫瘤中呈現(xiàn)出癌基因樣的作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要的作用。在結(jié)腸癌的研究中，Schetter等[5]檢測了84 例結(jié)腸癌組織及其癌旁正常組織的microRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)有37個microRNA表達存在差異, 其中miR-21在癌組織中表達顯著上調(diào), 證實miR-21與結(jié)腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)miR-21在乳腺癌組織中表達顯著上調(diào)，其表達上調(diào)水平與乳腺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)[6]。許多研究表明，microRNA具有調(diào)節(jié)下游靶基因表達的作用。在大多腫瘤中高表達的miR-21很可能是通過調(diào)節(jié)增殖、凋亡相關(guān)基因的表達而發(fā)揮促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。Park等[7]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的miR-21反義引物的核苷酸顯著抑制胰腺癌細胞株的增殖，抑制miR-21表達可使胰腺癌細胞株HS766T的凋亡增加3～6倍。我們的研究表明下調(diào)miR-21能夠明顯抑制結(jié)腸癌細胞對增殖及克隆形成能力等。

Figure 7. The inhibitory rate of cetuximab (300 mg/L) on the RKO cells with different treatments.Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs LV-anti-miR-21.

此外，miR-21在腫瘤藥物的耐藥性方面也有重要作用[8]。目前研究認為miR-21調(diào)控腫瘤細胞對多種藥物敏感性的機制主要與miR-21參與調(diào)控細胞周期、抑制細胞凋亡有關(guān)。最初由Meng等[9]關(guān)于microRNA與化療藥物敏感性的研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-21的表達能夠增加膽管癌細胞對吉西他濱的敏感性。深入研究機制，還發(fā)現(xiàn)miR-21通過激活PTEN依賴的PI3K信號通路從而調(diào)節(jié)吉西他濱介導(dǎo)的細胞凋亡，說明miR-21在調(diào)節(jié)腫瘤細胞化療敏感性方面有重要作用。Park等[7]也發(fā)現(xiàn)反義miR-21能夠增強吉西他濱的敏感性。我們通過上調(diào)/下調(diào)人結(jié)腸癌細胞RKO的miR-21表達水平，分析了miR-21對RKO細胞增殖、凋亡、克隆形成能力及對西妥昔單抗敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-21能夠抑制腫瘤細胞的增殖及克隆，增加腫瘤細胞對西妥昔單抗藥物的敏感性。這些結(jié)果表明miR-21的高表達可作為結(jié)直腸癌的分子標記物，下調(diào)miR-21的表達，在結(jié)直腸癌等腫瘤治療中有應(yīng)用前景，值得深入研究和驗證。

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