范彥英, 馬云鵬， 喬 圓， 何 萍， 張軒萍， Hiroshi OHTSU， 陳 忠

(1山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，山西 太原 030001； 2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)部，浙江 杭州 310058；3浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310009； 4東北大學(xué)醫(yī)學(xué)院，日本 仙臺(tái) 980-8775)

中樞組胺是腦內(nèi)的一種神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)，其可由組氨酸經(jīng)組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase, HDC)脫羧而成[1]。腦內(nèi)組胺主要分布于組胺能神經(jīng)元和肥大細(xì)胞中。組胺能神經(jīng)元胞體位于下丘腦結(jié)節(jié)乳頭核，該神經(jīng)元在腦內(nèi)有著廣泛而彌散的投射。組胺在腦內(nèi)通過(guò)作用于H1、H2和H3受體發(fā)揮著多種神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，如參與攝食、運(yùn)動(dòng)功能、學(xué)習(xí)記憶等生理過(guò)程。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，中樞組胺能神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)腦缺血早期的神經(jīng)損傷發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Adachi 等[2]在大鼠全腦缺血模型上，觀(guān)察到α-氟甲基組氨酸(α-fluromethylhistidine,α-FAM;一種選擇性的HDC 抑制劑)可加重缺血72 h 海馬CA1 區(qū)的神經(jīng)元死亡，而外源性給予組胺則能減輕沙鼠前腦缺血再灌7 d后的神經(jīng)元損傷[3]。進(jìn)一步的研究表明，H2受體可能參與了組胺的這種神經(jīng)保護(hù)作用。側(cè)腦室內(nèi)注射組胺H2受體拮抗劑ranitidine或cimetidine都會(huì)加重腦缺血再灌注損傷[3]。而給予組胺H2受體激動(dòng)劑dimaprit則可減輕大鼠全腦缺血引起的神經(jīng)元損傷[4]。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元上，組胺預(yù)處理能對(duì)抗NMDA 急性處理誘發(fā)的興奮性損傷，而這種作用是通過(guò)H2受體/cAMP/PKA通路介導(dǎo)的[5]。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，組胺還可能通過(guò)激動(dòng)組胺H1受體上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(glutamate transporter 1, GLT-1)和谷氨酰胺合成酶的表達(dá)來(lái)減輕腦缺血再灌急性期的神經(jīng)損傷[6-7]。這些證據(jù)均提示，組胺在腦缺血早期具有腦保護(hù)作用。但是，目前關(guān)于組胺抗腦缺血的研究主要集中評(píng)價(jià)了其在腦缺血早期(7 d以?xún)?nèi))所扮演的角色，且多采用藥理學(xué)手段，即外源性給予組胺或α-FMH及組胺受體拮抗劑。而內(nèi)源性組胺對(duì)腦缺血后期(數(shù)周)的學(xué)習(xí)記憶功能及神經(jīng)元損傷的影響尚不明確。

為此，本實(shí)驗(yàn)利用C57BL/6野生型(wild-type,WT)小鼠和組氨酸脫羧酶基因敲除(HDC-KO)小鼠(該小鼠由于無(wú)法將組氨酸脫羧為組胺，體內(nèi)長(zhǎng)期缺乏組胺[8])，來(lái)探討內(nèi)源性組胺對(duì)前腦缺血再灌后期條件性恐懼記憶和神經(jīng)元損傷的影響。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

雄性C57BL/6 WT小鼠(北京維通利華公司提供)和HDC-KO小鼠(從日本Ohtsu教授研究組引進(jìn))，體重22～25 g，周齡為8～10周。從2種基因型小鼠中各隨機(jī)抽取3只，提取小鼠尾部組織DNA，用PCR對(duì)動(dòng)物的HDC基因和neomycin基因進(jìn)行擴(kuò)增鑒定。擴(kuò)增HDC基因的引物序列為5′-AGTGAGGGACTGTGGCTCCACGTCGATGCT-3′ 和5′-TACAGTCAAAGTGTACCATCATCCACTTGG-3′ ，擴(kuò)增產(chǎn)物為147 bp；擴(kuò)增neomycin基因的引物序列為5′-AAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGG-3′和5′-ATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為244 bp。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵照國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南，動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度控制的環(huán)境[(22±1)℃]下，12 h明暗循環(huán)，自由飲食。

2 方法

2.1前腦缺血模型制備 將WT和HDC-KO小鼠各隨機(jī)分為對(duì)照組和缺血組，參照文獻(xiàn)[9]，以1%的戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉，鈍性分離小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，并利用動(dòng)脈瘤夾進(jìn)行夾閉，缺血30 min后再灌，并縫合傷口。對(duì)照組僅分離但不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈。動(dòng)物在手術(shù)時(shí)和能自主活動(dòng)前利用小動(dòng)物保溫毯保溫，肛溫均保持在36.5～37.5 ℃之間。

2.2體重監(jiān)測(cè) 在缺血前以及缺血后第1天到第7天及第14天對(duì)小鼠進(jìn)行稱(chēng)重，并做記錄。

2.3條件性恐懼記憶的測(cè)定 在前腦缺血再灌14 d時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行條件性恐懼記憶的檢測(cè)。將小鼠放入訓(xùn)練盒內(nèi)，經(jīng)過(guò)120 s的適應(yīng)后，給予30 s的2.8 kHz，84 dB的聲音刺激(條件刺激)，在聲音刺激的最后2 s，同時(shí)給予1 mA的電流刺激(非條件刺激)，刺激結(jié)束30 s后將小鼠從訓(xùn)練盒內(nèi)拿出。在訓(xùn)練后24 h，分別對(duì)每只小鼠進(jìn)行背景和線(xiàn)索記憶的測(cè)試，按照訓(xùn)練時(shí)的順序，依次將每只小鼠放入訓(xùn)練盒內(nèi)，不給予任何刺激，觀(guān)察300 s內(nèi)出現(xiàn)恐懼反應(yīng)(free-zing；即一種除呼吸運(yùn)動(dòng)外，全身其它軀體運(yùn)動(dòng)全部停止的狀態(tài))的次數(shù)。之后再依次將小鼠放入一個(gè)新的盒子，適應(yīng)120 s后，給予300 s的聲音刺激(2.8 kHz，84 dB)，但不給予電流刺激，觀(guān)察后300 s內(nèi)出現(xiàn)恐懼反應(yīng)的次數(shù)。恐懼反應(yīng)的次數(shù)通過(guò)計(jì)數(shù)300 s內(nèi)每5 s恐懼反應(yīng)的出現(xiàn)與否而得到。動(dòng)物恐懼反應(yīng)的程度最終以恐懼反應(yīng)出現(xiàn)的次數(shù)與觀(guān)察次數(shù)60的百分比來(lái)表示。

2.4病理切片及甲苯胺藍(lán)染色 前腦缺血再灌3 d及15 d，各組小鼠于1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉下經(jīng)左心室插管灌流。灌流液依次采用生理鹽水及4%多聚甲醛固定液。取出固定后的大腦置于同一固定液中進(jìn)行后固定24 h，后以30%蔗糖溶液脫水1周。使用冰凍切片機(jī)制備厚度為10 μm的海馬冠狀切片。切片室溫放置過(guò)夜晾干，0.01 mol/L PBS洗5 min，重復(fù)3次；1%甲苯胺藍(lán)染色20 min；1%鹽酸乙醇分化3～10 s；以95%、100%乙醇脫水各2 min，二甲苯透明，封片，對(duì)海馬CA1區(qū)的正常神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。采用SPSS 15.0軟件處理，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)或t檢驗(yàn)，動(dòng)物死亡率的比較采用似然比2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的HDC基因和neomycin基因的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果

如圖1所示，WT小鼠在147 bp處出現(xiàn)較強(qiáng)的HDC基因PCR擴(kuò)增條帶，而在244 bp附近則沒(méi)有出現(xiàn)條帶。相反，HDC-KO小鼠在WT小鼠應(yīng)出現(xiàn)HDC基因PCR擴(kuò)增條帶的相應(yīng)位置(147 bp處)并沒(méi)有出現(xiàn)任何條帶，而在244 bp附近出現(xiàn)neomycin替代基因的PCR擴(kuò)增條帶，證明我們所用的HDC-KO小鼠的HDC基因確實(shí)已被敲除，取而代之的是插入的neomycin基因，且為純合子。

Figure 1. Genotype identification of the mice by PCR. WT mice tested displayed a 147-bp band corresponding to the HDC gene fragment, whereas all HDC-KO mice tested showed a 244-bp band corresponding to the neomycin gene fragment.

2 WT與HDC-KO小鼠在前腦缺血再灌后不同時(shí)點(diǎn)的死亡率

小鼠前腦缺血再灌后的1～7 d，WT與HDC-KO小鼠均出現(xiàn)了死亡情況，但死亡率并無(wú)明顯差異；再灌后的8～14 d，剩余的8只WT小鼠均存活，而剩余的9只HDC-KO小鼠中的3只死亡，其死亡率顯著高于WT小鼠(P<0.05),見(jiàn)表1。

3 WT與HDC-KO小鼠在前腦缺血再灌后不同時(shí)點(diǎn)的體重變化

對(duì)再灌14 d 時(shí)仍存活的動(dòng)物的體重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前腦缺血再灌1 d 后，WT和HDC-KO小鼠的體重，與造模前相比均出現(xiàn)了明顯下降,但2組間的體重變化程度尚無(wú)明顯差異。再灌2 d 后，WT小鼠的體重開(kāi)始逐漸恢復(fù)，而HDC-KO小鼠體重在再灌 4 d 后開(kāi)始恢復(fù)。HDC-KO小鼠的體重恢復(fù)程度(即測(cè)量當(dāng)天與造模前體重的差值)在再灌4 d、5 d、6 d 及7 d 后均顯著低于WT小鼠，在再灌14 d 后仍有低于WT小鼠的趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異,見(jiàn)圖2。

表1 WT與HDC-KO小鼠在前腦缺血再灌后不同時(shí)點(diǎn)的死亡率

Figure 2. The changes of body weight at different time points after forebrain ischemia/reperfusion in WT and HDC-KO mice. The animals were applied with 30 min of bila-teral common carotid artery occlusion, and the body weight was observed at 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 14 d after reperfusion. The change of body weight is equal to the current body weight minus the body weight before ischemia.Mean±SEM. WT, n=8; HDC-KO, n=6. *P<0.05, ** P<0.01 vs WT.

4 WT與HDC-KO小鼠在前腦缺血再灌14 d的條件性恐懼記憶變化

在前腦缺血再灌14 d 時(shí)，對(duì)WT與HDC-KO小鼠進(jìn)行了條件性恐懼記憶的檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，WT和HDC-KO小鼠的對(duì)照組，其背景和線(xiàn)索記憶能力并無(wú)明顯差異。與相應(yīng)的對(duì)照組相比，WT和HDC-KO缺血組小鼠的背景和線(xiàn)索記憶能力均出現(xiàn)明顯下降，但HDC-KO小鼠的背景和線(xiàn)索記憶能力均顯著低于與WT小鼠(P<0.05)。

Figure 3. Fear conditioning at 14 d after forebrain ischemia/reperfusion in HDC-KO and WT mice. The animals were applied with 30 min of bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). A: contextual memory; B: cue memory. Mean±SEM. WT sham, n=6; HDC-KO sham, n=6; WT BCCAO, n=8; HDC-KO BCCAO, n=6. *P<0.05 vs WT sham; ##P<0.01 vs HDC-KO sham; △P<0.05 vs WT BCCAO.

5 WT與HDC-KO小鼠在前腦缺血再灌3 d 及15 d 的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度變化

在前腦缺血再灌 3 d 及 15 d 后WT與HDC-KO組小鼠腦片的甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果見(jiàn)圖4，對(duì)照組的WT與HDC-KO小鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度無(wú)明顯差異。前腦缺血再灌 3 d 后，與對(duì)照組相比，WT和HDC-KO小鼠的的缺血組均出現(xiàn)明顯的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失，但兩缺血組小鼠的神經(jīng)元密度未見(jiàn)顯著差異，而再灌15 d 后，HDC-KO組神經(jīng)元的缺失更為嚴(yán)重，神經(jīng)元計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示其神經(jīng)元密度，明顯低于WT小鼠(P<0.05)。

Figure 4. The hippocampal CA1 neuronal density at 3 d and 15 d after forebrain ischemia/reperfusion in HDC-KO and WT mice. The animals were applied with 30 min of bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO). A：the representative images of CA1 sector stained with toluidine blue. Scale bar=50 μm. B: quantitative evaluation of CA1 neuronal density at 3 d (n=6). C: quantitative evaluation of CA1 neuronal density at 15 d (WT sham, n=6; HDC-KO sham, n=6; WT BCCAO, n=8; HDC-KO BCCAO, n=6). Each value is expressed as percentages of the cell numbers in WT sham group. Mean±SEM. *P<0.05 vs WT sham; #P<0.05, ## P<0.01 vs HDC-KO sham; △P<0.05 vs WT BCCAO.

討 論

本實(shí)驗(yàn)利用HDC-KO小鼠研究了內(nèi)源性組胺對(duì)前腦缺血再灌后期腦損傷的調(diào)節(jié)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)源性組胺對(duì)前腦缺血再灌注損傷后期的學(xué)習(xí)記憶能力及神經(jīng)元損傷具有明顯改善作用。

組胺在腦缺血再灌早期的保護(hù)作用已經(jīng)被證實(shí)[2-4]。腦缺血后動(dòng)物體重下降的程度可以部分反映腦缺血損傷的嚴(yán)重程度[10-11]。已有的研究表明，中樞組胺可抑制小鼠攝食并降低體重，該作用可被H1受體拮抗劑所逆轉(zhuǎn)[12-13]。相似地，在H1受體敲除小鼠會(huì)表現(xiàn)為攝食過(guò)量和肥胖[14]。此外，組胺H3受體拮抗劑可通過(guò)反向調(diào)節(jié)H3受體增加組胺的合成與釋放，進(jìn)而抑制體重增加[15]。在本研究中，缺乏內(nèi)源性組胺的HDC-KO小鼠在腦缺血再灌2 d后的體重恢復(fù)程度低于WT小鼠，到4 d后出現(xiàn)顯著差異，提示內(nèi)源性組胺在腦缺血再灌早期可能通過(guò)其神經(jīng)保護(hù)作用間接加速了體重的恢復(fù)，而非直接增加動(dòng)物體重。然而，WT和HDC-KO小鼠在再灌3 d后的海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元密度及再灌1～7 d 內(nèi)的死亡率并未見(jiàn)顯著差異。本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，WT和HDC-KO小鼠在短暫性或永久性局灶性腦缺血 1 d 后的腦梗死體積沒(méi)有顯著差異[16-17]。這些與以往研究相矛盾的結(jié)果可能是由于HDC-KO小鼠腦內(nèi)長(zhǎng)期缺乏組胺，體內(nèi)出現(xiàn)的代償機(jī)制能夠部分代償腦缺血急性期內(nèi)源性組胺對(duì)神經(jīng)損傷的調(diào)節(jié)作用所造成的。

在腦缺血再灌后期，HDC-KO小鼠仍有33%的動(dòng)物死亡，而WT小鼠未出現(xiàn)動(dòng)物死亡，與此同時(shí)，在再灌 15 d 后，HDC-KO小鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺失比WT小鼠更為嚴(yán)重，提示內(nèi)源性組胺對(duì)腦缺血再灌后期的神經(jīng)元損傷具有抑制作用。腦缺血再灌注引發(fā)神經(jīng)元損傷的同時(shí)往往伴隨著學(xué)習(xí)記憶功能的下降[18-20]。盡管HDC-KO小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能在多種不同的學(xué)習(xí)記憶模型中都發(fā)生了改變[21]，但在本實(shí)驗(yàn)中，WT和HDC-KO小鼠對(duì)照組的條件恐懼記憶能力并未見(jiàn)顯著差異，而前腦缺血再灌14 d后，HDC-KO小鼠條件恐懼記憶能力的下降比WT小鼠更為嚴(yán)重，提示內(nèi)源性組胺對(duì)腦缺血后期的學(xué)習(xí)記憶能力有明顯改善作用。

內(nèi)源性組胺改善腦缺血后期神經(jīng)損傷及學(xué)習(xí)記憶功能的作用可能與其在缺血早期發(fā)揮的抑制興奮性神經(jīng)毒性作用有關(guān)。在局灶性腦缺血中發(fā)現(xiàn)，組胺可通過(guò)H2受體抑制谷氨酸的釋放[4, 22]。本課題組在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元上發(fā)現(xiàn)，組胺能保護(hù)NMDA誘發(fā)的興奮性損傷作用，而這種作用通過(guò)組胺H2受體所介導(dǎo)[5]。另外，組胺還可通過(guò)組胺H1受體促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1和谷氨酰胺合成酶的表達(dá)，進(jìn)而減少細(xì)胞外的谷氨酸濃度，從而減輕腦缺血早期發(fā)生的興奮性毒性損傷[6-7]。另外，本課題組最近的研究發(fā)現(xiàn)，低氧預(yù)處理誘導(dǎo)釋放的內(nèi)源性組胺可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)[17]。而VEGF對(duì)腦缺血后期的神經(jīng)損傷和修復(fù)具有重要調(diào)節(jié)作用[23-25]。我們推測(cè)，組胺在腦缺血再灌后期還可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)，減輕神經(jīng)損傷并促進(jìn)腦功能恢復(fù)。因此，內(nèi)源性組胺調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制可能是多方面的。

綜上所述，本研究利用HDC-KO小鼠發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性組胺可改善腦缺血長(zhǎng)期再灌注后的學(xué)習(xí)記憶功能，并減少神經(jīng)元損傷，但其具體機(jī)制還有待更深入的研究。

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